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18853850850金虫 (正式写手)
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关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
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图在图片上传中... 问题I：蛋白明显不纯，有大量蛋白存在于最终Elute Buffer中，大部分蛋白小于目的蛋白（约70KD）； 问题II：Bind Buffer中，目的蛋白含量较高，这个可能是结合树脂用量不够，或可能是带6*His标签的不完全表达短蛋白占据大量结合位点，如果真有此问题，应该怎样去解决？ 问题III：Wash buffer 起不到洗脱杂蛋白的作用，基中含有杂蛋白很少，倒有少部分是目的蛋白; 问题IV：含总蛋白量大的管（图中3）中蛋白很快析出，不知如何去溶解，没有办法保存。  SDS-PAGE电流图 |
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18853850850
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3楼2012-02-13 17:06:35
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1 buffer的pH应该避免在目的蛋白的pI值。 2 蛋白挂柱不明显的话可以考虑降低binding buffer中咪唑的浓度到5 mM，或者加入变性剂，以及上样时速度要控制在低速或反复上样以增加目的蛋白与柱子的结合时间 3 为了得到较纯的目的蛋白，可以增加洗涤次数，采用梯度洗脱。 4 蛋白可以用低浓度的10 mM Tris溶液保存，蛋白浓度不要过高。 5 检查表达菌中目的蛋白DNA序列是不是正确，终止子位置。 纯化时柱子最好要保持在低温环境，以防止蛋白大量降解。 |
5楼2012-02-14 14:27:57
2楼2012-02-13 16:38:12
zxc6884
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