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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
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18853850850

金虫 (正式写手)

[求助] 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白

图在图片上传中...
问题I：蛋白明显不纯，有大量蛋白存在于最终Elute Buffer中，大部分蛋白小于目的蛋白（约70KD）；
问题II：Bind Buffer中，目的蛋白含量较高，这个可能是结合树脂用量不够，或可能是带6*His标签的不完全表达短蛋白占据大量结合位点，如果真有此问题，应该怎样去解决？
问题III：Wash buffer 起不到洗脱杂蛋白的作用，基中含有杂蛋白很少，倒有少部分是目的蛋白;
问题IV：含总蛋白量大的管（图中3）中蛋白很快析出，不知如何去溶解，没有办法保存。

SDS-PAGE电流图
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学自己想知道的
1楼 2012-02-13 16:29:46
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回帖置顶 ( 共有2个 )

18853850850

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-02-13 16:38:12:
第一，你柱介质用的少一点，一般1ml 柱介质可以纯化10mg的靶蛋白
第二，靶蛋白没有完全挂上去，你到时候加固体尿素，终浓度搞到8M
第三，你是用什么溶液把蛋白洗脱下来的
第四，你纯化蛋白什么目的

1 .说明书上是这样说的，但明显是有相当一部分的目的蛋白没有结合上柱子；
2.Wash buffer是50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM 咪唑，pH8.0;
3 Elute buffer是50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM 咪唑pH8.0;
4.在天然条件下纯化，后面液体都不含有尿素；
5.纯化用来作抗原。
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学自己想知道的
3楼2012-02-13 17:06:35
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
18853850850(金币+5): 2012-02-14 15:53:30
silicare(金币+3, BioEPI+1): 鼓励发帖交流 2012-02-16 12:57:59
18853850850(金币+5): ★有帮助 2012-03-01 14:38:56
18853850850: 金币+5 2012-03-19 12:10:00
1 buffer的pH应该避免在目的蛋白的pI值。
2 蛋白挂柱不明显的话可以考虑降低binding buffer中咪唑的浓度到5 mM，或者加入变性剂，以及上样时速度要控制在低速或反复上样以增加目的蛋白与柱子的结合时间
3 为了得到较纯的目的蛋白，可以增加洗涤次数，采用梯度洗脱。
4 蛋白可以用低浓度的10 mM Tris溶液保存，蛋白浓度不要过高。
5 检查表达菌中目的蛋白DNA序列是不是正确，终止子位置。
纯化时柱子最好要保持在低温环境，以防止蛋白大量降解。
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5楼2012-02-14 14:27:57
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普通回帖

qjy_134

铜虫 (小有名气)
amisking(金币+3): 鼓励积极应助！ 2012-02-13 19:52:52
第一，你柱介质用的少一点，一般1ml 柱介质可以纯化10mg的靶蛋白
第二，靶蛋白没有完全挂上去，你到时候加固体尿素，终浓度搞到8M
第三，你是用什么溶液把蛋白洗脱下来的
第四，你纯化蛋白什么目的
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2楼2012-02-13 16:38:12
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
18853850850(金币+5): 2012-02-14 13:36:57
你是镍柱变性纯化，洗脱还是要加变性剂的，直接洗没那么容易复性。然后好像纯化前后没太大区别，非特异性结合太多，你可以把pH降到7.0或6.0试试。
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关注我关注的
4楼2012-02-13 22:23:29
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gsli1987

木虫 (正式写手)
我现在也遇到这个问题了，郁闷的不行啊
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每个人都生来孤独
6楼2012-02-15 14:52:29
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18853850850

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by gsli1987 at 2012-02-15 14:52:29:
我现在也遇到这个问题了，郁闷的不行啊

你好，请问你的蛋白是多大的？
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学自己想知道的
7楼2012-02-15 17:02:50
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gsli1987

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18853850850 at 2012-02-15 17:02:50:
你好，请问你的蛋白是多大的？

我的4W左右
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每个人都生来孤独
8楼2012-02-16 00:23:36
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18853850850

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by gsli1987 at 2012-02-16 00:23:36:
我的4W左右

蛋白小好纯化一点吧，我的一个30KD的蛋白就纯化的不错
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学自己想知道的
9楼2012-02-16 09:11:53
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linatracy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
18853850850: 金币+10 2012-03-16 14:22:46
洗涤的时候，应该做一个梯度洗涤！我现在在纯化的蛋白，用10mM，20mM，40mM，80mM......400mM,到时候可以看出后面洗脱的蛋白很纯，自己选择一个合适的洗涤液。我到300mM的洗脱液就洗脱的很干净，一遍就基本干净了，省着后面浓缩了。但是250mM洗脱的很好。
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10楼2012-03-15 16:09:27
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