| 查看: 3177 | 回复: 29 | ||||
[求助]
蛋白表达及纯化
|
||||
我现在在做真菌异源表达蛋白，发酵液处理之后跑的电泳见图，多出来的条带应该是我的目的条带，但是通过镍柱纯化不到，不知道是没有表达还是纯化的方法不对，各位有什么好的建议没，着急毕业，请各位帮帮忙! 第一个泳道为maker、第二泳道是野生型、剩下的泳道都是转化子 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有115人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤，注意事项！！！
已经有5人回复
- 【求助】新手求助！关于蛋白质异源表达纯化的问题
已经有4人回复
- 蛋白表达、纯化、活性检测和相关药理学实验，求推荐英文杂志，谢谢！！
已经有7人回复
- 蛋白在表达纯化处理的过程中起沫会有什么影响？
已经有5人回复
- 蛋白质的Ni柱纯化问题
已经有23人回复
- 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
已经有20人回复
- 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
已经有16人回复
- gst标签蛋白的表达和纯化
已经有17人回复
- 蛋白表达量少 怎么办
已经有11人回复
- gst标签，蛋白纯化
已经有25人回复
- 诚招有分子生物学及蛋白质表达纯化背景的博士一年级同学到美国来做抗体engineering
已经有16人回复
- 【求助/交流】离子交换纯化原核表达蛋白
已经有15人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌中蛋白表达量偏低，大家有什么建议？
已经有28人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
已经有29人回复
lifuzhu3838
金虫 (小有名气)
- 应助: 12 (小学生)
- 金币: 1186.8
- 帖子: 73
- 在线: 49小时
- 虫号: 1472777
- 注册: 2011-11-02
- 性别: GG
- 专业: 临床免疫学检验
10楼2013-07-17 13:55:19
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-16 19:12:16
liushuizhf: 金币+5, ★有帮助 2013-07-18 09:16:27
liushuizhf: 金币+5 2013-07-18 09:16:48
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-16 19:12:16
liushuizhf: 金币+5, ★有帮助 2013-07-18 09:16:27
liushuizhf: 金币+5 2013-07-18 09:16:48
|
昨天我正好和别人讨论了类似的问题，把与楼主可能有关的内容贴在这里。 楼主的弥散在目的带邻近的带可能是目的带的蛋白质发生了降解或则异常折叠，甚至于聚合。 建议检测与改进措施如下： 1.你测一下目标条带下的带的蛋白质的红外光谱和紫外光谱，与目的条带对比，如果两者的紫外光谱值明显不同，很可能折叠状态也不同，这是不测分子量的情况直接用光谱就能测定的，有时候折叠状态不同红外光谱也是相同的，因为二级结构未变，但是拓扑结构变了，三级结构也就变了。你在测定不同电泳带的蛋白质可能是折叠状态不一样时的同种蛋白质分子，用红外和紫外光谱很容易，但是首选要确定被研究的样品蛋白质的分子量相同，可以用质谱或者分子筛层析。 2.至于是否有降解，那要对目的条带和非目的条带测定分子量确定两者存在差异的话而后Ediman测序，其他没有好的对比办法。 3.用肽谱分析可能降解的重组蛋白质和目的蛋白质没有用。即用胰蛋白酶（或其他蛋白酶）同样条件下有限水解重组蛋白质和目的蛋白走电泳分析电泳片段，没有太用处，因为同一种蛋白质这的状态不同也可能会掩盖一些原有的酶切位点，何况蛋白质水解后可能引起重折叠或去折叠，所以引起酶切位点的暴露或被掩盖都是可能的。 4.如果想要知道是在转录水平还是翻译水平出的问题，直接检测mRNA的表达水平很麻烦，因为mRNA本身你很不稳定，讲解很快，利用northern测特异的mRNA的的表达水平的结果可能只有参考价值。建议同时在表达系统中添加光谱蛋白酶抑制剂（有现成商品出售），分梯度加入，而后用电泳检测目的蛋白质的含量变化。或者直接构建强启动子，必要的话加上enhancer，调节加强其他的表达的条件，可以使用分泌表达和包涵体，以排除水解的可能，也可以补偿在转录水平的不完全转录的情况，或者包涵体至少纯化起来方便。包涵体复性前可以包裹上滤纸，用锤子将包涵体砸成粉末，这样能够极大的增加包涵体与变形试剂接触的表面积，增大反应速率。 5.建议同时在表达系统中添加光谱蛋白酶抑制剂（有现成商品出售），分梯度加入，而后用电泳检测目的蛋白质的含量变化，只能在粉碎细胞或者分泌表达时进行，在活细胞内不能如此操作，因为很难透过细胞膜，即使透过了对细胞有什么具体影响很难预测. 6.要精确调查出你的目地蛋白质到底是在转录水平不完全还是翻译水平受阻或者翻译后被降解，必须随用细胞外转录和翻译系统，然后分别抑制转录，翻译和蛋白质水解酶。不能对活的工程细胞使用，因为那样还没有出结果，工程细胞先挂了。 7.有时不用找出具体原因，只要能够低成本的放大基因表达体系就行，密码子可以选用偏好密码子。 8.胞内表达可以在同样条件下收活细胞后，在溶液中加入广谱蛋白酶抑制剂和分梯度加入广谱蛋白酶抑制剂，然后在其他同样条件下粉碎细胞，比较目地蛋白质的收率。 镍柱纯化我就不说了。 |
2楼2013-07-16 11:03:43
lijian670417 
铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-16 19:12:23
liushuizhf: 金币+1 2013-07-18 09:17:59
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-16 19:12:23
liushuizhf: 金币+1 2013-07-18 09:17:59
|
本帖内容被屏蔽 |
3楼2013-07-16 17:55:26
11楼2013-07-17 13:56:19
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
12楼2013-07-18 11:25:44
4楼2013-07-16 21:38:11
5楼2013-07-16 21:40:19
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
6楼2013-07-16 23:14:33
7楼2013-07-17 08:50:37
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
8楼2013-07-17 09:20:33
★
感谢参与，应助指数 +1
liushuizhf: 金币+1 2013-07-18 09:17:28
感谢参与，应助指数 +1
liushuizhf: 金币+1 2013-07-18 09:17:28
|
本帖内容被屏蔽 |
9楼2013-07-17 09:24:20
10