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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
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泡泡9706

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】原核表达蛋白纯化已有15人参与

在大肠杆菌BL21中表达了一个酶，产生包涵体，优化后可以产生有活性的该酶。镍柱纯化时在目的条带附近总伴随有另一条带（或者多条），用了离子交换除不去，而且也不知道哪条是我的目的条带。有图

请高人指教有何办法将其分纯？
  另外：包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时，条带一定在同一位置出现吗？

[ Last edited by 泡泡9706 on 2010-6-13 at 11:13 ]
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1楼2010-06-12 17:02:35
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):欢迎交流！ 2010-06-12 21:18:40
泡泡9706(金币+1):这样啊，谢谢！ 2010-06-13 08:32:50
包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时，目的条带一般是相同位置的，不过你这个纯化不容易，帮顶一下
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2楼2010-06-12 17:18:47
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:04
泡泡9706(金币+1):多谢指教 2010-06-17 17:03:47
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:05:51
可能都是，信号肽的有无，原核么，很可能有的把信号肽切了，有的没有切，或者二者都存在，你查下外文文献，有说的，希望对你有帮助~
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3楼2010-06-13 16:59:37
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黑罕

金虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:11
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:57
泡泡9706(金币+1):做了western，用的his标签的抗体，都能染出来……据说国产的抗体特异性不好…… 2010-06-17 17:04:28
做wester blot 鉴定出你的条带，如果还不行就只能做质谱了
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4楼2010-06-13 18:35:03
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:06:26
貌似不容易分开，分子筛估计都难
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5楼2010-06-13 20:04:40
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mazhenning

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:29
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:51
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:06:34
有没有重复一下，都是接近的两条带吗？
我之前也有过同一种蛋白，但是跑出来会有两条紧挨的带，不过我那种情况是蛋白电泳的问题。所以，也许你这两条带都是你的目标蛋白。或者是电泳条件，或者是被分解等原因，导致成了两条带。
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6楼2010-06-13 20:13:15
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:07:35
western 检测看看！
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7楼2010-06-13 20:22:54
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临风7071

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by mazhenning at 2010-06-13 20:13:15:
有没有重复一下，都是接近的两条带吗？
我之前也有过同一种蛋白，但是跑出来会有两条紧挨的带，不过我那种情况是蛋白电泳的问题。所以，也许你这两条带都是你的目标蛋白。或者是电泳条件，或者是被分解等原因，导 ...

我想问一下楼主，蛋白电泳出现什么问题会出现两条紧挨的带呢？
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8楼2010-06-14 19:01:24
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gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:43
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:07:49
你表达的酶基因是不是含有信号肽序列？如果有，可能该信号肽在大肠杆菌胞内可溶表达部分被切去了信号肽，而包涵体表达部分没有被切去信号肽，这样导致了出现这两条吧！如果有该酶的抗体，你做一下western blot检测，如果两条都与抗体结合并显带，就可能是我说的这个原因！
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大家共同交流、共同提高！！！
9楼2010-06-15 00:43:24
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-15 13:27:07
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:08:00
怀疑是构象不同引起的。
想问楼主离子交换柱洗脱峰的对称性如何？  
另外检查目的蛋白中半胱氨酸的个数。如果有两个以上，蛋白纯化过程中是否全程加的有还原剂？
电泳的时候使用的 Loading buffer 中是否加入还原剂，如果目的蛋白中确实存在二硫键，加不加还原剂电泳结果确实会存在差异。
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10楼2010-06-15 08:46:50
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