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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
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Originally posted by biogefart at 2010-06-17 20:28:45:


这是不可能的！！！不溶的包涵体怎么会挂在可溶蛋白的Ni柱上，楼主肯定不是用的包涵体的纯化方法吧！！

对，我只是纯的可溶部分的组份
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21楼2010-06-18 10:59:16
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gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by biogefart at 2010-06-17 20:28:45:


这是不可能的！！！不溶的包涵体怎么会挂在可溶蛋白的Ni柱上，楼主肯定不是用的包涵体的纯化方法吧！！

这可不好说！：）
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大家共同交流、共同提高！！！
22楼2010-06-27 14:47:53
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
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655801楼: Originally posted by 月月大可 at 2010-06-15 08:46:50:
怀疑是构象不同引起的。
想问楼主离子交换柱洗脱峰的对称性如何？  
另外检查目的蛋白中半胱氨酸的个数。如果有两个以上，蛋白纯化过程中是否全程加的有还原剂？
电泳的时候使用的 Loading buffer 中是否加入还 ...

请教一下~如果蛋白中有半胱氨酸，蛋白纯化过程加还原剂，比如巯基乙醇，浓度和pH应该多大才能起到保护巯基的作用？是从细菌离心那步就要开始加还原剂还是培养的时候就要加？
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23楼2012-05-10 10:30:29
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月月大可

木虫 (著名写手)
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1178376楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-05-10 10:30:29:
请教一下~如果蛋白中有半胱氨酸，蛋白纯化过程加还原剂，比如巯基乙醇，浓度和pH应该多大才能起到保护巯基的作用？是从细菌离心那步就要开始加还原剂还是培养的时候就要加？

好多年前的帖子了，早就忘记我还回复过这个帖子。重新温习了一下，才确定是我说的,呵呵。
浓度具体多少忘记了，貌似我当时加的是2-5mM吧，因为我要使用Ni柱纯化，如果浓度过高，它就将Ni离子还原为+1价，失去抓取蛋白的能力，EDTA也无法剥离，几乎就是柱子报废。    pH要跟去你蛋白的需求，但是在不同pH和温度环境下β巯基乙醇的半衰期会不同，几分钟几十分钟还是几小时，不记得了。自己查查吧，曾经见过的。  从你的裂解buffer就开始加入，菌体裂解后目的蛋白就处在还原环境中。
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24楼2012-05-10 17:05:07
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
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1178391楼: Originally posted by 月月大可 at 2012-05-10 17:05:07:
好多年前的帖子了，早就忘记我还回复过这个帖子。重新温习了一下，才确定是我说的,呵呵。
浓度具体多少忘记了，貌似我当时加的是2-5mM吧，因为我要使用Ni柱纯化，如果浓度过高，它就将Ni离子还原为+1价，失去抓 ...

多谢呀~救急的回复啊！我之前也是查过说巯基乙酸酸性下稳定，但是碱性下才起作用，但是具体的没查到。
我也是要过Ni柱，说明书上说的浓度不能超过20mM。

那我还想请教一下，全程加还原剂，最后总是要透析去除巯基乙醇的吧？还是说一直蛋白纯化之后的，也是以含巯基乙醇的缓冲液做溶剂？
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25楼2012-05-10 18:06:41
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月月大可

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1178393楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-05-10 18:06:41:
多谢呀~救急的回复啊！我之前也是查过说巯基乙酸酸性下稳定，但是碱性下才起作用，但是具体的没查到。
我也是要过Ni柱，说明书上说的浓度不能超过20mM。

那我还想请教一下，全程加还原剂，最后总是要透析去除 ...

没错，GE的说明书确实写可以耐受20mM，但是我用到5mM的时候就会看到变黑的Ni离子稀里哗啦的往下掉。所以我都是2mM作用。 为何要除去？ 影响你后期的实验？我长晶体用的，从来都是全程加入，直到最后都保留。
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26楼2012-05-10 18:35:13
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
1178394楼: Originally posted by 月月大可 at 2012-05-10 18:35:13:
没错，GE的说明书确实写可以耐受20mM，但是我用到5mM的时候就会看到变黑的Ni离子稀里哗啦的往下掉。所以我都是2mM作用。 为何要除去？ 影响你后期的实验？我长晶体用的，从来都是全程加入，直到最后都保留。

后期还要做个应用，因为巯基乙醇里也有巯基，蛋白里也有巯基，起作用的就是巯基，共存巯基乙醇了就说不清是谁起作用了。
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27楼2012-05-10 18:38:29
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月月大可

木虫 (著名写手)
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1178395楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-05-10 18:38:29:
后期还要做个应用，因为巯基乙醇里也有巯基，蛋白里也有巯基，起作用的就是巯基，共存巯基乙醇了就说不清是谁起作用了。

去了巯基乙醇，就有可能形成二硫键，一样影响你测定
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28楼2012-05-10 18:43:08
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
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1178396楼: Originally posted by 月月大可 at 2012-05-10 18:43:08:
去了巯基乙醇，就有可能形成二硫键，一样影响你测定

好的，明白了，谢谢~可能我需要另外一个不含巯基的还原缓冲环境。
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29楼2012-05-10 19:07:46
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929519755

金虫 (正式写手)
★
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你跑电泳时，上样缓冲液里面有没有加β-巯基乙醇？
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想你没话说
30楼2013-08-14 14:24:05
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