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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
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泡泡9706

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】原核表达蛋白纯化 已有15人参与

在大肠杆菌BL21中表达了一个酶，产生包涵体，优化后可以产生有活性的该酶。镍柱纯化时在目的条带附近总伴随有另一条带（或者多条），用了离子交换除不去，而且也不知道哪条是我的目的条带。有图

请高人指教有何办法将其分纯？
  另外：包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时，条带一定在同一位置出现吗？

[ Last edited by 泡泡9706 on 2010-6-13 at 11:13 ]
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1楼 2010-06-12 17:02:35
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1178376楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-05-10 10:30:29:
请教一下~如果蛋白中有半胱氨酸，蛋白纯化过程加还原剂，比如巯基乙醇，浓度和pH应该多大才能起到保护巯基的作用？是从细菌离心那步就要开始加还原剂还是培养的时候就要加？

好多年前的帖子了，早就忘记我还回复过这个帖子。重新温习了一下，才确定是我说的,呵呵。
浓度具体多少忘记了，貌似我当时加的是2-5mM吧，因为我要使用Ni柱纯化，如果浓度过高，它就将Ni离子还原为+1价，失去抓取蛋白的能力，EDTA也无法剥离，几乎就是柱子报废。    pH要跟去你蛋白的需求，但是在不同pH和温度环境下β巯基乙醇的半衰期会不同，几分钟几十分钟还是几小时，不记得了。自己查查吧，曾经见过的。  从你的裂解buffer就开始加入，菌体裂解后目的蛋白就处在还原环境中。
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24楼2012-05-10 17:05:07
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):欢迎交流！ 2010-06-12 21:18:40
泡泡9706(金币+1):这样啊，谢谢！ 2010-06-13 08:32:50
包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时，目的条带一般是相同位置的，不过你这个纯化不容易，帮顶一下
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2楼2010-06-12 17:18:47
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:04
泡泡9706(金币+1):多谢指教 2010-06-17 17:03:47
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:05:51
可能都是，信号肽的有无，原核么，很可能有的把信号肽切了，有的没有切，或者二者都存在，你查下外文文献，有说的，希望对你有帮助~
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3楼2010-06-13 16:59:37
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黑罕

金虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:11
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:57
泡泡9706(金币+1):做了western，用的his标签的抗体，都能染出来……据说国产的抗体特异性不好…… 2010-06-17 17:04:28
做wester blot 鉴定出你的条带，如果还不行就只能做质谱了
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4楼2010-06-13 18:35:03
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