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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
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泡泡9706

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】原核表达蛋白纯化 已有15人参与

在大肠杆菌BL21中表达了一个酶，产生包涵体，优化后可以产生有活性的该酶。镍柱纯化时在目的条带附近总伴随有另一条带（或者多条），用了离子交换除不去，而且也不知道哪条是我的目的条带。有图

请高人指教有何办法将其分纯？
  另外：包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时，条带一定在同一位置出现吗？

[ Last edited by 泡泡9706 on 2010-6-13 at 11:13 ]
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1楼 2010-06-12 17:02:35
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-15 13:27:07
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:08:00
怀疑是构象不同引起的。
想问楼主离子交换柱洗脱峰的对称性如何？  
另外检查目的蛋白中半胱氨酸的个数。如果有两个以上，蛋白纯化过程中是否全程加的有还原剂？
电泳的时候使用的 Loading buffer 中是否加入还原剂，如果目的蛋白中确实存在二硫键，加不加还原剂电泳结果确实会存在差异。
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10楼2010-06-15 08:46:50
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk:还有这样的啊，有意思~~ 2010-06-18 11:06:00
引用回帖:
Originally posted by 泡泡9706 at 2010-06-17 17:08:34:

这个蛋白只有一个半胱氨酸

偶感觉还是构象的问题可能比较大，我原来把不同批次的蛋白混合在一起，然后跑SDS-PAGE出来了三条带，都是我的目的蛋白。

不同菌落、不同批次纯化出来的蛋白构象可能不一样。
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17楼2010-06-17 19:10:11
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月月大可

木虫 (著名写手)
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引用回帖:
1178376楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-05-10 10:30:29:
请教一下~如果蛋白中有半胱氨酸，蛋白纯化过程加还原剂，比如巯基乙醇，浓度和pH应该多大才能起到保护巯基的作用？是从细菌离心那步就要开始加还原剂还是培养的时候就要加？

好多年前的帖子了，早就忘记我还回复过这个帖子。重新温习了一下，才确定是我说的,呵呵。
浓度具体多少忘记了，貌似我当时加的是2-5mM吧，因为我要使用Ni柱纯化，如果浓度过高，它就将Ni离子还原为+1价，失去抓取蛋白的能力，EDTA也无法剥离，几乎就是柱子报废。    pH要跟去你蛋白的需求，但是在不同pH和温度环境下β巯基乙醇的半衰期会不同，几分钟几十分钟还是几小时，不记得了。自己查查吧，曾经见过的。  从你的裂解buffer就开始加入，菌体裂解后目的蛋白就处在还原环境中。
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24楼2012-05-10 17:05:07
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月月大可

木虫 (著名写手)
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引用回帖:
1178393楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-05-10 18:06:41:
多谢呀~救急的回复啊！我之前也是查过说巯基乙酸酸性下稳定，但是碱性下才起作用，但是具体的没查到。
我也是要过Ni柱，说明书上说的浓度不能超过20mM。

那我还想请教一下，全程加还原剂，最后总是要透析去除 ...

没错，GE的说明书确实写可以耐受20mM，但是我用到5mM的时候就会看到变黑的Ni离子稀里哗啦的往下掉。所以我都是2mM作用。 为何要除去？ 影响你后期的实验？我长晶体用的，从来都是全程加入，直到最后都保留。
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26楼2012-05-10 18:35:13
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1178395楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-05-10 18:38:29:
后期还要做个应用，因为巯基乙醇里也有巯基，蛋白里也有巯基，起作用的就是巯基，共存巯基乙醇了就说不清是谁起作用了。

去了巯基乙醇，就有可能形成二硫键，一样影响你测定
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28楼2012-05-10 18:43:08
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