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泡泡9706

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[交流] 【求助/交流】原核表达蛋白纯化已有15人参与

在大肠杆菌BL21中表达了一个酶，产生包涵体，优化后可以产生有活性的该酶。镍柱纯化时在目的条带附近总伴随有另一条带（或者多条），用了离子交换除不去，而且也不知道哪条是我的目的条带。有图

请高人指教有何办法将其分纯？
另外：包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时，条带一定在同一位置出现吗？

[ Last edited by 泡泡9706 on 2010-6-13 at 11:13 ]

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1楼 2010-06-12 17:02:35

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泡泡9706

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Originally posted by mazhenning at 2010-06-13 20:13:15:
有没有重复一下，都是接近的两条带吗？
我之前也有过同一种蛋白，但是跑出来会有两条紧挨的带，不过我那种情况是蛋白电泳的问题。所以，也许你这两条带都是你的目标蛋白。或者是电泳条件，或者是被分解等原因，导 ...

我也想问一下，蛋白电泳的什么问题会导致这样呢？

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13楼2010-06-17 17:07:07

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泡泡9706

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Originally posted by 月月大可 at 2010-06-15 08:46:50:
怀疑是构象不同引起的。
想问楼主离子交换柱洗脱峰的对称性如何？
另外检查目的蛋白中半胱氨酸的个数。如果有两个以上，蛋白纯化过程中是否全程加的有还原剂？
电泳的时候使用的 Loading buffer 中是否加入还 ...

这个蛋白只有一个半胱氨酸

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14楼2010-06-17 17:08:34

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Originally posted by ganchao1776 at 2010-06-15 13:24:44:
建议你用低温过夜诱导，可能就不会去现你的这种情况了，而且目标蛋白的丰度也会高很多了。你的这种现象在37度诱导时出现在概率不是很大，但也不是很难遇见，原因不是很简单，楼上几位说的都有可能，我的意见是蛋白 ...

我是低温诱导的

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15楼2010-06-17 17:09:09

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