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scauchjy

金虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】帮忙分析下western结果已有3人参与

各位战友，我做的是香蕉果实一个转录因子的western，大小26 kDa左右，上样30 ug，我们做过考染，条带比较清晰，抗体是委托公司通过原核表达，蛋白纯化和兔血清纯化得来的，二抗是promega的羊抗兔带AP标记。我们的转膜条件是100 毫安转6 h，封闭液是3%BSA+TBST，4度封闭过夜，一抗浓度1：2000，反应3 h，二抗使用浓度1：5000，反应1 h。NBT和BCIP显色。我这个图片显色时间较长。得到的结果是条带多，目的条带为图片箭头所示。请大家帮忙分析下是啥原因，是不是封闭不好还是一抗使用浓度高了？多谢了！

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1楼 2009-12-31 19:37:33

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boouy

银虫 (正式写手)

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封闭不好

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2楼2010-01-01 02:41:07

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liudaihualyh

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★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

你的杂带比目的带清楚多了，建议你一抗洗脱的时间延长，你是用的多长时间？WB我觉得有一句话很重要：“慢工出细活”，欲速则不达，我每次不急不慢做的总是最好的，但敢时间做的总有遗憾，还有就是你最好在实验室搞个固定的流程，温度和湿度，这样把每次的试验条件都固定，千万不要轻易改动，这样对于你以后结果的重复性非常重要。