24小时热门版块排行榜    

查看: 2873  |  回复: 7

迷情八月

金虫 (正式写手)

[交流] western-blot实验结果,大家帮忙分析下 已有4人参与

我最近在做一个关于纯化抗体的课题,抗原E-coli表达后,自己纯化的 ,跑胶的时候,发现比较纯,只有一条目的蛋白的主带。然后免疫小鼠 筛选杂交瘤细胞,抗体纯化后,用western检测抗体的纯度,实验结果如下图,上样孔分别是:Maker(自己做的,没预染,所以看不到);阴性对照,Ecoli(1:10稀释)空菌;阴性对照,Ecoli(1:100稀释)裂解液;目的蛋白(1:10)稀释;目的蛋白(1:100)稀释;目的蛋白(1:500)稀释。目的大小23KD。
        实验结果,阴性对照孔两个基本上没有颜色,可以断定我们的抗体和细菌蛋白是没有交叉反应的;目的蛋白均能染出颜色,但令人纠结的是,为什么1:10稀释的目的蛋白(颜色最亮的那条)上方会多出一条带(对了一下maker,大约50左右)?
       这个实验结果是否能说明,我得到的抗体是纯的?求大神指点


[ Last edited by 迷情八月 on 2012-3-17 at 14:27 ]
回复此楼

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

迷情八月

金虫 (正式写手)

自己先顶一下
2楼2012-03-17 14:28:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lcppp1974

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我估计会不会是你目标蛋白的二聚体?因为目标蛋白的MW=23 kDa,  23 x 2 = 46 kDa.在电泳水平上,46和50 kDa是很难区分的。更何况50 kDa你也是估计的。因此建议你加入ME或DTT(切断双硫键)后再试一次,如果是-SS-键,那你加入还原剂后就会变成一条带。希望该休息对你有用。
3楼2012-03-17 15:46:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

水水726

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果是杂带的话,是不是你一抗浓度太大了,稀释下试试
4楼2012-03-17 21:10:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

迷情八月

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lcppp1974 at 2012-03-17 15:46:02:
我估计会不会是你目标蛋白的二聚体?因为目标蛋白的MW=23 kDa,  23 x 2 = 46 kDa.在电泳水平上,46和50 kDa是很难区分的。更何况50 kDa你也是估计的。因此建议你加入ME或DTT(切断双硫键)后再试一次,如果是-SS- ...

我上的是还原的buffer,我们自己也认为可能是形成二聚体了,会不会是二聚体的浓度太高了,DTT还来不及还原?
5楼2012-03-19 08:18:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lcppp1974

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
蛋白样品中你最好用DTT,它能较稳定地把SS还原为SH,且要加大浓度,因为我推测你的目标蛋白中的SH很容易形成SS,因此要加过量的DTT。

还有,也许你的还原时间不够。还原条件:沸水,5min。常温,>5h.

仅供参考。
6楼2012-03-19 13:30:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

快乐女孩h

铜虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我们一般是加过量的DTT来还原的,而且1沸水浴10min
其实越简单的生活越幸福
7楼2012-04-10 20:17:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

日子妞儿

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
送红花一朵
有些蛋白出现扎带也是很正常的  多余的位置会有
我是黑妞儿 哈哈
8楼2014-11-14 14:23:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 迷情八月 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +6 一鸭鸭哟 2026-03-14 7/350 2026-03-15 22:12 by Winj1e
[考研] 中科院材料273求调剂 +3 yzydy 2026-03-15 3/150 2026-03-15 21:15 by ms629
[考研] 0703化学调剂 ,六级已过,有科研经历 +4 曦熙兮 2026-03-15 4/200 2026-03-15 18:01 by JourneyLucky
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油!? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 268求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-14 6/300 2026-03-14 22:20 by 运气yunqi
[考研] 本科南京大学一志愿川大药学327 +3 麦田耕者 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:04 by 外星文明
[考研] 中科大材料专硕319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-13 3/150 2026-03-14 18:10 by houyaoxu
[基金申请] 面上和青基一样限30页不合理 +5 wowsunflower 2026-03-10 7/350 2026-03-14 17:21 by kingkocxr
[考研] 【0703化学调剂】-一志愿华中师范大学-六级475 +5 Becho359 2026-03-11 5/250 2026-03-14 11:35 by 哦哦123
[考研] 求调剂! +4 朔朔话 2026-03-09 4/200 2026-03-14 01:38 by JourneyLucky
[考研] 279求调剂 +3 抓着星星的女孩 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:47 by userper
[考研] 材料371求调剂 +9 鳄鱼? 2026-03-11 11/550 2026-03-13 22:53 by JourneyLucky
[考研] (081700)化学工程与技术-298分求调剂 +12 11啦啦啦 2026-03-11 35/1750 2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[考研] 0703化学求调剂 +7 绿豆芹菜汤 2026-03-12 7/350 2026-03-13 17:25 by njzyff
[考研] 290求调剂 +7 ADT 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:17 by JourneyLucky
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
[考研] 070303一志愿西北大学学硕310找调剂 +3 d如愿上岸 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:43 by houyaoxu
[考研] 一志愿河海大学085900土木水利专硕279求调剂不挑专业 +4 SunWwWwWw 2026-03-10 8/400 2026-03-13 02:23 by SunWwWwWw
[考研] 求调剂材料专硕293 +6 段_(:з」∠)_ 2026-03-10 6/300 2026-03-10 18:22 by ms629
信息提示
请填处理意见