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western-blot的问题！！！已有4人参与
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各位大神，你们好： 小弟最近做目的蛋白WB检测，从植物种子中粗提蛋白，两块胶，一快染色，一快WB。 问题是：阳性对照有条带，很清晰（阳性对照为纯化的蛋白），而检测的蛋白却没有条带，而用ELISA检测同样的检测样品，结果呈阳性。为什么ELISA能检测出来，而WB检测不出来呢？ 上样量做过梯度，转膜电流、时间也摸索过 但是为什么会出现这种情况呢？还请各位大神显灵吧，小弟拜谢了！ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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hellokkzhu
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【答案】应助回帖
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一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ： 原因分析 解决办法 1.一抗和二抗失效 1. 更换抗体；选择现用现配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物 3.发光液失效 3. 更换新的发光液 4.抗体染色不充分 4. 增加抗体浓度；延长孵育时间 5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质； 增加样品 的上样量。 6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂 6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂 7.抗体活力降低 7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配 二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。 |
6楼2014-07-12 00:52:20