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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western-blot的问题！！！
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lxyzsx

新虫 (初入文坛)

[求助] western-blot的问题！！！ 已有4人参与

各位大神，你们好：

    小弟最近做目的蛋白WB检测，从植物种子中粗提蛋白，两块胶，一快染色，一快WB。
    问题是：阳性对照有条带，很清晰（阳性对照为纯化的蛋白），而检测的蛋白却没有条带，而用ELISA检测同样的检测样品，结果呈阳性。为什么ELISA能检测出来，而WB检测不出来呢？
    上样量做过梯度，转膜电流、时间也摸索过
    但是为什么会出现这种情况呢？还请各位大神显灵吧，小弟拜谢了！
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1楼 2014-02-25 19:31:21
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hellokkzhu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般情况，elisa的灵敏度比wb要高100-1000倍，所以elisa有阳性结果wb不一定检测到条带。如果蛋白较小比如10kd以下，wb的检测更不灵敏。
建议：用纯化蛋白作为标准品做elisa定量，看你的目的蛋白丰度，如果丰度低可以加大上样量，提高抗体工作液浓度。
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2楼2014-02-25 20:04:20
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puhebio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ELISA和WB的灵敏度完全不是一个级别，Elisa的检测限可以达到ng级别，可能是你的目的蛋白量比较少，上样量的摸索时，你所看到的条带多数是你的杂蛋白，另外转膜后面加抗体孵育、显色的时候也查查有没有问题。
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3楼2014-02-25 22:24:25
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lxyzsx

新虫 (初入文坛)
ok,再试试上样量，和一抗fuyu时间，谢谢！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-02-26 06:41:01
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turnaward

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

他们的作用好像不是一样的吧！wb是和变性的蛋白结合的而elise却不是的。所以可能和你的抗体有关的吧。如果不是这个原因找到了给我回一下的哈、
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5楼2014-02-28 22:10:39
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ：
        原因分析                                                                        解决办法         
1.一抗和二抗失效                                                        1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                     2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                              3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                        4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低    5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                    增加样品 的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                         6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                     7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。
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6楼2014-07-12 00:52:20
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