应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western Blot 磷酸化蛋白测定问题
101/1返回列表
查看: 6067  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jqjs

新虫 (初入文坛)

[交流] Western Blot 磷酸化蛋白测定问题 已有8人参与

WB菜鸟最近做ERK蛋白表达

用的碧云天的Western及IP细胞裂解液（说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测）
伯乐半干转膜 恒压20V，25min
5%脱脂奶室温摇床封闭1h
一抗室温摇床1h，4度过夜
HRP标记的二抗室温摇床孵育1小时
TMB显色

结果：ERK蛋白表达有条带
          p-ERK在NC膜上只有预染Marker没有任何条带或是背景

请教WB达人为什么p-ERK会是这样的情况，还有这个问题要怎么解决？
各位大侠赐教呀！！！

[ Last edited by amisking on 2009-10-15 at 22:05 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验 免疫学实验经验

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

miandui

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2009-10-15 20:50:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南湖山下

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我的ERK也很悲剧，总是背景很脏，怎么洗也洗不掉，有高手能指点一下吗
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-04-11 13:03:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

314300420

捐助贵宾 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by jqjs at 2009-10-15 20:50:46:
WB菜鸟最近做ERK蛋白表达

用的碧云天的Western及IP细胞裂解液（说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测）
伯乐半干转膜 恒压20V，25min
5%脱脂奶室温摇床封闭1h
一抗室温摇床1h，4度过夜
HRP标记的二抗室温摇 ...

磷酸化蛋白封闭和稀释一抗建议用3%BSA，不选择奶粉，如果你的Erk或者内参能出的很好，只有p-Erk不出，可以考虑是一抗的问题，可以加大抗体浓度，或者换抗体
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-04-11 14:56:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

314300420

捐助贵宾 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 南湖山下 at 2011-04-11 13:03:38:
我的ERK也很悲剧，总是背景很脏，怎么洗也洗不掉，有高手能指点一下吗

目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。
赞一下(6人) 回复此楼
4楼2011-04-11 15:06:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

miandui
送鲜花一朵
5楼2012-08-14 20:43:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liushang1990

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
呃，制样有没有加磷酸酶抑制剂？最好用新鲜的蛋白样品，并且裂解液里加了磷酸酶抑制剂。
赞一下 回复此楼
基督耶稣降世，为要拯救罪人。
6楼2013-08-13 17:18:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ：
        原因分析                                                                        解决办法         
1.一抗和二抗失效                                                        1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                     2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                              3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                        4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低    5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                    增加样品 的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                         6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                     7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2014-07-12 00:47:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小强001

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 314300420 at 2011-04-11 15:06:02
目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。

...

大神啊，这么亮的条带，请教一下，磷酸化抗体用的哪个公司的啊
赞一下 回复此楼
无
8楼2014-07-28 17:07:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxf128

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 314300420 at 2011-04-11 15:06:02
目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。

...

您好 求教一下 我做WB pakt通路 是用总AKT做内参还是用GAPDH做内参
赞一下 回复此楼
9楼2015-09-06 20:55:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

恩彩

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 314300420 at 2011-04-11 15:06:02
目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。

...

我想请教一下sds电泳的条件电压 电流 时间～
赞一下 回复此楼
10楼2019-04-16 15:12:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jqjs 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +32 医学老男孩 2026-08-13 74/3700 2026-08-16 21:05 by 医学老男孩
[论文投稿] 岩土工程学报什么时候才能终审完呐 25+3 yeager111 2026-08-10 4/200 2026-08-16 20:42 by tfang
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +9 Ldrop2023 2026-08-13 9/450 2026-08-16 13:24 by wukun_007
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +11 家与远方 2026-08-10 16/800 2026-08-16 10:28 by ray43
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭