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Western Blot 磷酸化蛋白测定问题 已有8人参与
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WB菜鸟最近做ERK蛋白表达 用的碧云天的Western及IP细胞裂解液（说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测） 伯乐半干转膜 恒压20V，25min 5%脱脂奶室温摇床封闭1h 一抗室温摇床1h，4度过夜 HRP标记的二抗室温摇床孵育1小时 TMB显色 结果：ERK蛋白表达有条带 p-ERK在NC膜上只有预染Marker没有任何条带或是背景 请教WB达人为什么p-ERK会是这样的情况，还有这个问题要怎么解决？ 各位大侠赐教呀！！！ [ Last edited by amisking on 2009-10-15 at 22:05 ] |
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2楼2011-04-11 13:03:38
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6楼2013-08-13 17:18:32
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- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
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一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ： 原因分析 解决办法 1.一抗和二抗失效 1. 更换抗体；选择现用现配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物 3.发光液失效 3. 更换新的发光液 4.抗体染色不充分 4. 增加抗体浓度；延长孵育时间 5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质； 增加样品 的上样量。 6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂 6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂 7.抗体活力降低 7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配 二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。 |
7楼2014-07-12 00:47:02
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