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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western Blot 磷酸化蛋白测定问题
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jqjs

新虫 (初入文坛)

[交流] Western Blot 磷酸化蛋白测定问题已有8人参与

WB菜鸟最近做ERK蛋白表达

用的碧云天的Western及IP细胞裂解液（说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测）
伯乐半干转膜 恒压20V，25min
5%脱脂奶室温摇床封闭1h
一抗室温摇床1h，4度过夜
HRP标记的二抗室温摇床孵育1小时
TMB显色

结果：ERK蛋白表达有条带
          p-ERK在NC膜上只有预染Marker没有任何条带或是背景

请教WB达人为什么p-ERK会是这样的情况，还有这个问题要怎么解决？
各位大侠赐教呀！！！

[ Last edited by amisking on 2009-10-15 at 22:05 ]
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miandui

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1楼2009-10-15 20:50:46
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南湖山下

新虫 (初入文坛)
★
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我的ERK也很悲剧，总是背景很脏，怎么洗也洗不掉，有高手能指点一下吗
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2楼2011-04-11 13:03:38
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314300420

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Originally posted by jqjs at 2009-10-15 20:50:46:
WB菜鸟最近做ERK蛋白表达

用的碧云天的Western及IP细胞裂解液（说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测）
伯乐半干转膜 恒压20V，25min
5%脱脂奶室温摇床封闭1h
一抗室温摇床1h，4度过夜
HRP标记的二抗室温摇 ...

磷酸化蛋白封闭和稀释一抗建议用3%BSA，不选择奶粉，如果你的Erk或者内参能出的很好，只有p-Erk不出，可以考虑是一抗的问题，可以加大抗体浓度，或者换抗体
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3楼2011-04-11 14:56:39
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314300420

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Originally posted by 南湖山下 at 2011-04-11 13:03:38:
我的ERK也很悲剧，总是背景很脏，怎么洗也洗不掉，有高手能指点一下吗

目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。
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4楼2011-04-11 15:06:02
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miandui
送鲜花一朵
5楼2012-08-14 20:43:28
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liushang1990

木虫 (小有名气)
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呃，制样有没有加磷酸酶抑制剂？最好用新鲜的蛋白样品，并且裂解液里加了磷酸酶抑制剂。
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基督耶稣降世，为要拯救罪人。
6楼2013-08-13 17:18:32
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ：
        原因分析                                                                        解决办法         
1.一抗和二抗失效                                                        1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                     2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                              3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                        4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低    5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                    增加样品 的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                         6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                     7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。
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7楼2014-07-12 00:47:02
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小强001

铁虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 314300420 at 2011-04-11 15:06:02
目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。

...

大神啊，这么亮的条带，请教一下，磷酸化抗体用的哪个公司的啊
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无
8楼2014-07-28 17:07:51
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sxf128

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 314300420 at 2011-04-11 15:06:02
目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。

...

您好 求教一下 我做WB pakt通路 是用总AKT做内参还是用GAPDH做内参
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9楼2015-09-06 20:55:07
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恩彩

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 314300420 at 2011-04-11 15:06:02
目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。

...

我想请教一下sds电泳的条件电压 电流 时间～
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10楼2019-04-16 15:12:00
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