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zplipeng

金虫 (著名写手)

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[交流] Western Blot实验的蛋白条带都连在一起

如题：
探测内参actin的时候，各个条带并不很浓，但都连在一起，看不出泳道来。
会是什么原因。
另：有时转膜会出现星星样的小点，布满整个凝胶。
大分子量蛋白往往有转移不好的情况，虽然并不影响自己探测的蛋白。
以下附上WB的详细步骤：
1、细胞总蛋白的提取
A、用培养皿（10cm）或培养瓶（75cm2）将细胞（Hela或HepG2）培养至约80-90%的平铺率；
B、倒去培养基，并用PBS冲洗2-3次；
C、加入0.5-1ml胰酶，37℃消化3-10min；
D、加入3mL无血清培养基终止消化反应，并用枪头反复吹打至细胞从培养壁上脱落；
E、收集细胞悬液至15mL离心管中，1500rpm离心10min收集细胞体（约100uL体积大小）；
F、用500uL PBS重悬细胞并转移至1.5mL离心管中，3000-5000rpm离心5min收集细胞；
G、弃去上清并用枪头吸干液体，加入50-200uL裂解液（RIPA已加入蛋白酶抑制剂），吹打均匀后，冰上放置20min，液氮反复冻融2-3次；
H、 14000×g离心15min，将上清收集到新的离心管中；
I、以BSA为基准测定蛋白吸光度及浓度（约5-35mg/mL）。
2、 SDS-PAGE
A、配置12%的分离胶（20mL）和3%的浓缩胶（10mL）；
B、用2×Loading buffer（15uL）与蛋白提取液（15uL）等体积混匀后，沸水浴中煮5-10min；
C、每孔上样20uL样品，5uL预染蛋白Marker，没有样品的孔加入5uL 2×Loading buffer；
D、调节电压100V（或先80V再120V）电泳90-120min；
E、转膜的胶水中暂存，另一块可以直接染色（考马斯亮蓝染液中煮沸5-10min，脱色）。
3、转膜
A、用转膜缓冲液浸湿转膜器件（夹子、滤纸、垫片）并依次排好；
B、将剪好的PVDF膜（0.45um）（比胶略大但比滤纸小）先在甲醇中浸湿（不超过15s），后覆盖在正极滤纸上；
C、随后将胶覆盖在PVDF膜上；
D、再放上一层滤纸后，用玻璃棒或15mL离心管赶出气泡；
E、夹好夹子，放入转移槽，加满转移缓冲液；
F、 20V转移过夜，一块膜时电流大约为13-15mA，用的是六一的转移槽；
G、转好的膜放入TBST缓冲液中。
4、免疫印迹
A、用TBST配置的5%脱脂奶封闭膜（4℃过夜或37℃ 1hr）；
B、用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入一抗（1:300（β-actin）），37℃孵育1hr（或4℃过夜）；
C、 TBST洗涤膜5min，2次，然后用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入二抗（1:5000，牛抗兔二抗），37℃孵育1hr；
D、 TBST洗涤膜5min，2次，用于显色反应。
5、发光反应
A、加入一定量ECL（整块膜大约需要2.5-3mL的ECL混合液），将膜全部覆盖；
B、 5min后，移入暗室准备压片（光片剪角），视荧光强度选择压片时间；
C、压片10s-2min，后分别显影（可在灯下观察显影强度，控制显影时间），定影（2min即可）；
D、膜保存在TBST中，可反复利用。

总蛋白SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色：可见泳道间扩散相连

actin的WB结果连成一条线而看不出泳道

转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染色有时会出现星星样的点点

但大部分还是这种情况：90kD一下蛋白转移较好，而大分子量蛋白往往转移不好（20V overnight）

[ Last edited by zplipeng on 2011-12-8 at 14:34 ]

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