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Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
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lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-12-06 12:18:37
zplipeng(金币+1): 用的RIPA提取缓冲液,网上找的配方。您的意思是Loading buffer中溴酚蓝质量有问题还是量加的可能不对? 2011-12-08 14:38:38
zplipeng(金币+2): 我们的抗体是博奥森公司的(国产),1:1000的做过,出不来条带。ECL的量也有影响吗?个人觉得只要铺满整个膜是不是就可以了!转膜在300mA中转1.5h我也用过,效果也是如此。另外询问一个问题,您做过信号转导方面的东西,是不是磷酸化蛋白检测时需要的浓度时比较大的?我用非磷酸化抗体探测时可以探测到条带(也不粗),但是磷酸化蛋白的抗体总是探测不到条带,不知是真的没有表达,还是探测的问题。 2011-12-08 20:49:10
zplipeng(金币+5): 我们老板购买的Roche的蛋白酶抑制剂,他说他们做蛋白磷酸化就用这个,不用再加磷酸酶抑制剂。我表示怀疑。 2011-12-12 19:30:24
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zplipeng(金币+1): 用的RIPA提取缓冲液,网上找的配方。您的意思是Loading buffer中溴酚蓝质量有问题还是量加的可能不对? 2011-12-08 14:38:38
zplipeng(金币+2): 我们的抗体是博奥森公司的(国产),1:1000的做过,出不来条带。ECL的量也有影响吗?个人觉得只要铺满整个膜是不是就可以了!转膜在300mA中转1.5h我也用过,效果也是如此。另外询问一个问题,您做过信号转导方面的东西,是不是磷酸化蛋白检测时需要的浓度时比较大的?我用非磷酸化抗体探测时可以探测到条带(也不粗),但是磷酸化蛋白的抗体总是探测不到条带,不知是真的没有表达,还是探测的问题。 2011-12-08 20:49:10
zplipeng(金币+5): 我们老板购买的Roche的蛋白酶抑制剂,他说他们做蛋白磷酸化就用这个,不用再加磷酸酶抑制剂。我表示怀疑。 2011-12-12 19:30:24
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照你说的情况看,是你的蛋白样品在胶里扩散性太强了,所以可能是你样品制作的有问题吧,检查一下loading buffer的配制可有问题,特别使样品下沉的溴酚蓝;还有就是电泳时的电压和时间也会影响电泳结果;如果实验室的此实验条件不成熟,还要好好摸索啊,祝你好运! 我个人认为是Loading buffer中溴酚蓝的量的问题,质量有问题肯定也有影响; 从你的方法和图片看,个人认为:你actin抗体的浓度可能大了(我们实验室内参一抗浓度1:1000,当然具体要看抗体来源和说明),ECL的量和压片时间没把握好,导致你actin的WB显影结果连成一条线而看不出泳道; 转膜大分子转不过来应该是你转膜条件不佳(我们实验室是300mA冰中转1.5h) 你再查些资料看看问题到底在哪儿吧,祝好运! 我觉得磷酸化的蛋白是不太好检测,蛋白少信号弱可适当加大上样量,做磷酸化的蛋白RIPA一定要加磷酸酶抑制剂,我们的RIPA是购买的含磷酸酶抑制剂的,您自己配制也应该加进去 [ Last edited by cuier124 on 2011-12-12 at 09:13 ] |
6楼2011-12-05 21:58:28
33楼2013-06-10 11:03:04
3楼2011-12-05 08:28:42
4楼2011-12-05 08:49:59
5楼2011-12-05 16:30:26
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lvanmorison
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