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[交流]
Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
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如题： 探测内参actin的时候，各个条带并不很浓，但都连在一起，看不出泳道来。 会是什么原因。 另：有时转膜会出现星星样的小点，布满整个凝胶。 大分子量蛋白往往有转移不好的情况，虽然并不影响自己探测的蛋白。 以下附上WB的详细步骤： 1、 细胞总蛋白的提取 A、 用培养皿（10cm）或培养瓶（75cm2）将细胞（Hela或HepG2）培养至约80-90%的平铺率； B、 倒去培养基，并用PBS冲洗2-3次； C、 加入0.5-1ml胰酶，37℃消化3-10min； D、 加入3mL无血清培养基终止消化反应，并用枪头反复吹打至细胞从培养壁上脱落； E、 收集细胞悬液至15mL离心管中，1500rpm离心10min收集细胞体（约100uL体积大小）； F、 用500uL PBS重悬细胞并转移至1.5mL离心管中，3000-5000rpm离心5min收集细胞； G、 弃去上清并用枪头吸干液体，加入50-200uL裂解液（RIPA已加入蛋白酶抑制剂），吹打均匀后，冰上放置20min，液氮反复冻融2-3次； H、 14000×g离心15min，将上清收集到新的离心管中； I、 以BSA为基准测定蛋白吸光度及浓度（约5-35mg/mL）。 2、 SDS-PAGE A、 配置12%的分离胶（20mL）和3%的浓缩胶（10mL）； B、 用2×Loading buffer（15uL）与蛋白提取液（15uL）等体积混匀后，沸水浴中煮5-10min； C、 每孔上样20uL样品，5uL预染蛋白Marker，没有样品的孔加入5uL 2×Loading buffer； D、 调节电压100V（或先80V再120V）电泳90-120min； E、 转膜的胶水中暂存，另一块可以直接染色（考马斯亮蓝染液中煮沸5-10min，脱色）。 3、 转膜 A、 用转膜缓冲液浸湿转膜器件（夹子、滤纸、垫片）并依次排好； B、 将剪好的PVDF膜（0.45um）（比胶略大但比滤纸小）先在甲醇中浸湿（不超过15s），后覆盖在正极滤纸上； C、 随后将胶覆盖在PVDF膜上； D、 再放上一层滤纸后，用玻璃棒或15mL离心管赶出气泡； E、 夹好夹子，放入转移槽，加满转移缓冲液； F、 20V转移过夜，一块膜时电流大约为13-15mA，用的是六一的转移槽； G、 转好的膜放入TBST缓冲液中。 4、 免疫印迹 A、 用TBST配置的5%脱脂奶封闭膜（4℃过夜或37℃ 1hr）； B、 用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入一抗（1:300（β-actin）），37℃孵育1hr（或4℃过夜）； C、 TBST洗涤膜5min，2次，然后用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入二抗（1:5000，牛抗兔二抗），37℃孵育1hr； D、 TBST洗涤膜5min，2次，用于显色反应。 5、 发光反应 A、 加入一定量ECL（整块膜大约需要2.5-3mL的ECL混合液），将膜全部覆盖； B、 5min后，移入暗室准备压片（光片剪角），视荧光强度选择压片时间； C、 压片10s-2min，后分别显影（可在灯下观察显影强度，控制显影时间），定影（2min即可）； D、 膜保存在TBST中，可反复利用。  总蛋白SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色：可见泳道间扩散相连  actin的WB结果 连成一条线而看不出泳道  转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染色 有时会出现星星样的点点  但大部分还是这种情况：90kD一下蛋白转移较好，而大分子量蛋白往往转移不好（20V overnight） [ Last edited by zplipeng on 2011-12-8 at 14:34 ] |
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zplipeng(金币+1): 用的RIPA提取缓冲液，网上找的配方。您的意思是Loading buffer中溴酚蓝质量有问题还是量加的可能不对？ 2011-12-08 14:38:38
zplipeng(金币+2): 我们的抗体是博奥森公司的（国产），1:1000的做过，出不来条带。ECL的量也有影响吗？个人觉得只要铺满整个膜是不是就可以了！转膜在300mA中转1.5h我也用过，效果也是如此。另外询问一个问题，您做过信号转导方面的东西，是不是磷酸化蛋白检测时需要的浓度时比较大的？我用非磷酸化抗体探测时可以探测到条带（也不粗），但是磷酸化蛋白的抗体总是探测不到条带，不知是真的没有表达，还是探测的问题。 2011-12-08 20:49:10
zplipeng(金币+5): 我们老板购买的Roche的蛋白酶抑制剂，他说他们做蛋白磷酸化就用这个，不用再加磷酸酶抑制剂。我表示怀疑。 2011-12-12 19:30:24
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-12-06 12:18:37
zplipeng(金币+1): 用的RIPA提取缓冲液，网上找的配方。您的意思是Loading buffer中溴酚蓝质量有问题还是量加的可能不对？ 2011-12-08 14:38:38
zplipeng(金币+2): 我们的抗体是博奥森公司的（国产），1:1000的做过，出不来条带。ECL的量也有影响吗？个人觉得只要铺满整个膜是不是就可以了！转膜在300mA中转1.5h我也用过，效果也是如此。另外询问一个问题，您做过信号转导方面的东西，是不是磷酸化蛋白检测时需要的浓度时比较大的？我用非磷酸化抗体探测时可以探测到条带（也不粗），但是磷酸化蛋白的抗体总是探测不到条带，不知是真的没有表达，还是探测的问题。 2011-12-08 20:49:10
zplipeng(金币+5): 我们老板购买的Roche的蛋白酶抑制剂，他说他们做蛋白磷酸化就用这个，不用再加磷酸酶抑制剂。我表示怀疑。 2011-12-12 19:30:24
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照你说的情况看，是你的蛋白样品在胶里扩散性太强了，所以可能是你样品制作的有问题吧，检查一下loading buffer的配制可有问题，特别使样品下沉的溴酚蓝；还有就是电泳时的电压和时间也会影响电泳结果；如果实验室的此实验条件不成熟，还要好好摸索啊，祝你好运！ 我个人认为是Loading buffer中溴酚蓝的量的问题，质量有问题肯定也有影响； 从你的方法和图片看，个人认为：你actin抗体的浓度可能大了(我们实验室内参一抗浓度1:1000，当然具体要看抗体来源和说明)，ECL的量和压片时间没把握好，导致你actin的WB显影结果连成一条线而看不出泳道； 转膜大分子转不过来应该是你转膜条件不佳（我们实验室是300mA冰中转1.5h） 你再查些资料看看问题到底在哪儿吧，祝好运！ 我觉得磷酸化的蛋白是不太好检测，蛋白少信号弱可适当加大上样量，做磷酸化的蛋白RIPA一定要加磷酸酶抑制剂，我们的RIPA是购买的含磷酸酶抑制剂的，您自己配制也应该加进去 [ Last edited by cuier124 on 2011-12-12 at 09:13 ] |
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