24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zplipeng

金虫 (著名写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1191.1
帖子: 1411
在线: 65.7小时
虫号: 583579

[交流] Western Blot实验的蛋白条带都连在一起

如题：
探测内参actin的时候，各个条带并不很浓，但都连在一起，看不出泳道来。
会是什么原因。
另：有时转膜会出现星星样的小点，布满整个凝胶。
大分子量蛋白往往有转移不好的情况，虽然并不影响自己探测的蛋白。
以下附上WB的详细步骤：
1、细胞总蛋白的提取
A、用培养皿（10cm）或培养瓶（75cm2）将细胞（Hela或HepG2）培养至约80-90%的平铺率；
B、倒去培养基，并用PBS冲洗2-3次；
C、加入0.5-1ml胰酶，37℃消化3-10min；
D、加入3mL无血清培养基终止消化反应，并用枪头反复吹打至细胞从培养壁上脱落；
E、收集细胞悬液至15mL离心管中，1500rpm离心10min收集细胞体（约100uL体积大小）；
F、用500uL PBS重悬细胞并转移至1.5mL离心管中，3000-5000rpm离心5min收集细胞；
G、弃去上清并用枪头吸干液体，加入50-200uL裂解液（RIPA已加入蛋白酶抑制剂），吹打均匀后，冰上放置20min，液氮反复冻融2-3次；
H、 14000×g离心15min，将上清收集到新的离心管中；
I、以BSA为基准测定蛋白吸光度及浓度（约5-35mg/mL）。
2、 SDS-PAGE
A、配置12%的分离胶（20mL）和3%的浓缩胶（10mL）；
B、用2×Loading buffer（15uL）与蛋白提取液（15uL）等体积混匀后，沸水浴中煮5-10min；
C、每孔上样20uL样品，5uL预染蛋白Marker，没有样品的孔加入5uL 2×Loading buffer；
D、调节电压100V（或先80V再120V）电泳90-120min；
E、转膜的胶水中暂存，另一块可以直接染色（考马斯亮蓝染液中煮沸5-10min，脱色）。
3、转膜
A、用转膜缓冲液浸湿转膜器件（夹子、滤纸、垫片）并依次排好；
B、将剪好的PVDF膜（0.45um）（比胶略大但比滤纸小）先在甲醇中浸湿（不超过15s），后覆盖在正极滤纸上；
C、随后将胶覆盖在PVDF膜上；
D、再放上一层滤纸后，用玻璃棒或15mL离心管赶出气泡；
E、夹好夹子，放入转移槽，加满转移缓冲液；
F、 20V转移过夜，一块膜时电流大约为13-15mA，用的是六一的转移槽；
G、转好的膜放入TBST缓冲液中。
4、免疫印迹
A、用TBST配置的5%脱脂奶封闭膜（4℃过夜或37℃ 1hr）；
B、用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入一抗（1:300（β-actin）），37℃孵育1hr（或4℃过夜）；
C、 TBST洗涤膜5min，2次，然后用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入二抗（1:5000，牛抗兔二抗），37℃孵育1hr；
D、 TBST洗涤膜5min，2次，用于显色反应。
5、发光反应
A、加入一定量ECL（整块膜大约需要2.5-3mL的ECL混合液），将膜全部覆盖；
B、 5min后，移入暗室准备压片（光片剪角），视荧光强度选择压片时间；
C、压片10s-2min，后分别显影（可在灯下观察显影强度，控制显影时间），定影（2min即可）；
D、膜保存在TBST中，可反复利用。

总蛋白SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色：可见泳道间扩散相连

actin的WB结果连成一条线而看不出泳道

转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染色有时会出现星星样的点点

但大部分还是这种情况：90kD一下蛋白转移较好，而大分子量蛋白往往转移不好（20V overnight）

[ Last edited by zplipeng on 2011-12-8 at 14:34 ]

回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

科研学习

Wb相关

» 猜你喜欢

自荐读博已经有7人回复
自然科学基金委宣布启动申请书“瘦身提质”行动已经有4人回复
投稿Elsevier的杂志（返修），总是在选择OA和subscription界面被踢皮球已经有6人回复
求个博导看看已经有18人回复
青基代表作，AAAI之类的A会的special track在国内认可度高吗？还是归为workshop之流？已经有3人回复
上海工程技术大学【激光智能制造】课题组招收硕士已经有6人回复
上海工程技术大学张培磊教授团队招收博士生已经有4人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

western-blot实验结果，大家帮忙分析下已经有7人回复
western blot中蛋白质转印问题已经有17人回复
请教western blot 时蛋白稀释液情况已经有4人回复
western blot 请教已经有10人回复
Western blot 检测胱氨酸谷氨酸转运体蛋白表达已经有6人回复
Western Blot电泳蛋白质外漏问题求助已经有22人回复
新手求助western blot 已经有22人回复
【分享】新手上路 Western blot问题集合已经有6人回复
【求助/交流】western blot 显影后发现条带中空，求解答。已经有8人回复
【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？已经有9人回复
【求助/交流】请教Western blot出现非特异性条带的怎么解决已经有8人回复
【求助/交流】western blot中，蛋白经SDSPAGE后不是变性了吗，怎么还能和一抗结合？已经有13人回复
Western Blot 磷酸化蛋白测定问题已经有9人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2011-12-04 21:15:25

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

vine010

银虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 395.1
帖子: 144
在线: 33.5小时
虫号: 455486

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): 蛋白量感觉也不多，因为最后的WB条带并不粗。我用的12%的分离胶。 2011-12-08 14:36:40

量加多了，胶的浓度是不是有问题。

赞一下(1人)

回复此楼

5楼2011-12-05 16:30:26

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

查看全部 38 个回答

cuier124

金虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 564.6
帖子: 24
在线: 40.7小时
虫号: 930770

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-12-06 12:18:37
zplipeng(金币+1): 用的RIPA提取缓冲液，网上找的配方。您的意思是Loading buffer中溴酚蓝质量有问题还是量加的可能不对？ 2011-12-08 14:38:38
zplipeng(金币+2): 我们的抗体是博奥森公司的（国产），1:1000的做过，出不来条带。ECL的量也有影响吗？个人觉得只要铺满整个膜是不是就可以了！转膜在300mA中转1.5h我也用过，效果也是如此。另外询问一个问题，您做过信号转导方面的东西，是不是磷酸化蛋白检测时需要的浓度时比较大的？我用非磷酸化抗体探测时可以探测到条带（也不粗），但是磷酸化蛋白的抗体总是探测不到条带，不知是真的没有表达，还是探测的问题。 2011-12-08 20:49:10
zplipeng(金币+5): 我们老板购买的Roche的蛋白酶抑制剂，他说他们做蛋白磷酸化就用这个，不用再加磷酸酶抑制剂。我表示怀疑。 2011-12-12 19:30:24

照你说的情况看，是你的蛋白样品在胶里扩散性太强了，所以可能是你样品制作的有问题吧，检查一下loading buffer的配制可有问题，特别使样品下沉的溴酚蓝；还有就是电泳时的电压和时间也会影响电泳结果；如果实验室的此实验条件不成熟，还要好好摸索啊，祝你好运！

我个人认为是Loading buffer中溴酚蓝的量的问题，质量有问题肯定也有影响；
从你的方法和图片看，个人认为：你actin抗体的浓度可能大了(我们实验室内参一抗浓度1:1000，当然具体要看抗体来源和说明)，ECL的量和压片时间没把握好，导致你actin的WB显影结果连成一条线而看不出泳道；
转膜大分子转不过来应该是你转膜条件不佳（我们实验室是300mA冰中转1.5h）
你再查些资料看看问题到底在哪儿吧，祝好运！

我觉得磷酸化的蛋白是不太好检测，蛋白少信号弱可适当加大上样量，做磷酸化的蛋白RIPA一定要加磷酸酶抑制剂，我们的RIPA是购买的含磷酸酶抑制剂的，您自己配制也应该加进去

[ Last edited by cuier124 on 2011-12-12 at 09:13 ]

赞一下(3人)

回复此楼

6楼2011-12-05 21:58:28

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖