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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western Blot电泳蛋白质外漏问题求助
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qiang7

金虫 (小有名气)

[求助] Western Blot电泳蛋白质外漏问题求助

求助各位高手指点，本人最近蛋白电泳过程中经常出现在蛋白样品刚跑离样品孔还没进入分离胶的时候，样品就漏下来了！如下图所示。在我想的问题都找遍了，比如浓缩胶浓缩时间，玻璃板清洗问题及玻璃板都换新的了，还有试剂都换了一套，还是漏 真不知道还有什么致命因素没有找到，请各位大侠指点！小弟将不胜感激！
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1楼2011-05-18 10:33:22
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫

【答案】应助回帖

qiang7(金币+5): 谢谢您的热心，我再细细的查找一遍 2011-05-22 15:19:27
amisking(EPI+1): 2011-05-22 19:58:35
肯定是你液体配制中的问题，这是我的配方，可以参考一下。
1. 试剂配制
1.1母液
1.1.1  1.0mol/L Tris•HCl      
Tris (MW121.14)      30.29g
蒸馏水               200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH                         HCl
7.4                         约17ml
7.5                         约16m
7.6                         约15ml
8.0                         约10ml

1.1.2        1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
1.1.3        0.2mol/L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸馏水至 500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.1.4        0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO •12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸馏水至 1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.1.5        10％SDS  
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
1.1.6        10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）
1.1.7        1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14)    45.43g
超纯水             200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.1.8        0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14)     15.14g
超纯水              200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.1.9        40％Acr/Bic（37.5:1）
丙稀酰胺（Acr）         37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic）   1g
超纯水至                100ml
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
1.1.10        30％Acr/Bic（29:1）
丙稀酰胺（Acr）         29g
甲叉双丙稀酰胺（Bic）   1g
超纯水至                100ml
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
1.1.11        20％Tween20
Tween20      20ml
蒸馏水至     100ml
混匀后4℃保存。
1.2 使用液配制
1.2.1  单去污剂裂解液（PMSF）：
1mol/L Tris•HCl（pH8.0）  2.5ml
NaCl                       0.438g
TritonX-100                0.5ml
蒸馏水至                   50ml
混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
一般实际用的比较多的其实是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方：
50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。
        裂解得到的蛋白样品，由于含有较高的蛋白去垢剂干扰，不能用Brandford法测定蛋白浓度,要用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
        RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。
1.2.2  0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4       19ml
0.2 mol/L Na2HPO4       81ml
NaCl                    17g
蒸馏水至                2000ml
1.2.3        G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）
考马斯亮蓝G250     100mg
95％乙醇            50ml
磷酸                100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
1.2.4        0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44）   0.877g
蒸馏水至          100 ml
高温灭菌后，室温保存。
1.2.5  100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA                0.1g
0.15 mol/L NaCl    1ml
溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。
1.2.6  还原型5 X SDS上样缓冲液
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）         2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）      0.39g
SDS                                0.5g
溴酚蓝                              0.025
甘油                                2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
1.2.7        电泳液缓冲液
Tris（MW121.14）       3.03g
甘氨酸（MW75.07）      18.77g
SDS                    1g
蒸馏水至               1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）
1.2.8        转移缓冲液
甘氨酸（MW75.07）        2.9g
Tris（MW121.14）         5.8g
SDS                      0.37g
甲醇                     200ml
蒸馏水至                 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）
1.2.9        10X丽春红染液
丽春红S         2g
三氯乙酸         30g
磺基水杨酸       30g
蒸馏水至         100ml
使用时将其稀释10倍。
1.2.10  TBS缓冲液
1 mol/L Tris•HCl（pH7.5）     10ml
NaCl                         8.8g
蒸馏水至                     1000ml
（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
1.2.10        TBST缓冲液
20％Tween20        1.65ml
TBS                700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
1.2.11        封闭液 (最好现配现用)
脱脂奶粉（国产，光明牌）     5g
TBST                         100ml
1.2.12 洗脱抗体缓冲液（可用可不用）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇)       700 μl（通风厨里加）
SDS                                           2g
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）                      12.5ml
超纯水至                                        100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
1.2.18  40%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制
组    分        10％分离胶（两块胶，10ml）        4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水               4.85ml                            3.16ml
40％Acr/Bic（37.5:1）    2.5ml                             0.5ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 2.5ml                               －
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）  －                               1.26ml
10％ SDS              100 μl                              50 μl
10% AP                50 μl                               25μl
TEMED              5 μl                                 5 μl
*加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）
组    分          15％分离胶（两块胶，10ml）     7.8％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水                  2.34 ml                            2.065 ml
40％ Acr/Bic（37.5:1）       3.75 ml                            0.975 ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）    3.75 ml                               －
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）      －                              1.875 ml
10％ SDS                  100 μl                              50 μl
10% AP                    50 μl                               25μl
TEMED                  10μl                                5 μl


1.2.19  30%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制

        SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
*丙烯酰胺浓度（%）                          线性分离范围（kD）
15                                         12～43
10                                         16～68
7.5                                         36～94
5.0                                         57～212
*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
        配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液
溶液成分        总体积 5ml        总体积 10ml        总体积 15ml        总体积 20ml        总体积 25ml        总体积 30ml
6%         
水        2.6ml        5.3ml        7.9ml        10.6ml        13.2ml        15.9ml
30%丙烯酰胺        1.0ml        2.0ml        3.0ml        4.0ml        5.0ml        6.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        4μl        8μl        12μl        16μl        20μl        24μl
8%       
水        2.3ml        4.6ml        6.9ml        9.3ml        11.5ml        13.9ml
30%丙烯酰胺        1.3ml        2.7ml        4.0ml        5.3ml        6.7ml        8.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        3μl        6μl        9μl        12μl        15μl        18μl
10%       
水        1.9ml        4.0ml        5.9ml        7.9ml        9.9ml        11.9ml
30%丙烯酰胺        1.7ml        3.3ml        5.0ml        6.7ml        8.3ml        10.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        2μl        4μl        6μl        8μl        10μl        12μl
12%       
水        1.6ml        3.3ml        4.9ml        6.6ml        8.2ml        9.9ml
30%丙烯酰胺        2.0ml        4.0ml        6.0ml        8.0ml        10.0ml        12.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        2μl        4μl        6μl        8μl        10μl        12μl
15%       
水        1.1ml        2.3ml        3.4ml        4.6ml        5.7ml        6.9ml
30%丙烯酰胺        2.5ml        5.0ml        7.5ml        10.0ml        12.5ml        15.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        2μl        4μl        6μl        8μl        10μl        12μl

配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液
溶液成分        总体积
3ml        总体积
4ml        总体积
5ml        总体积
6ml        总体积
8ml
水        2.1ml        2.7ml        3.4ml        4.1ml        5.5ml
30%丙烯酰胺        0.5ml        0.67ml        0.83ml        1.0ml        1.3ml
1M Tris(pH 6.8)        0.38ml        0.5ml        0.63ml        0.75ml        1.0ml
10% SDS        30μl        40μl        50μl        60μl        80μl
10%过硫酸胺        30μl        40μl        50μl        60μl        80μl
TEMED        3μl        4μl        5μl        6μl        8μl
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梦在路就在！
9楼2011-05-22 11:07:16
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xuguanghai

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
qiang7(金币+1): 浓缩胶都浓缩了近1h了 还有没有什么关键因素啊？ 2011-05-18 11:11:22
adslye(金币+1): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-09-26 09:11:13
会不会是分离胶中的聚丙酰胺没有聚合，蛋白没有孔径进入分离胶，一般30分钟左右分离胶都能聚合，TEMED的量不能太多，只是起加速聚合作用，多的话会使胶变硬，变脆，胶容易裂开，蛋白肯定就跑不进孔径里了。觉得可能还是胶那里出了问题。

http://www.app17.com/dating/d805.html
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3楼2011-05-18 10:47:56
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grapes

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
qiang7(金币+2): 您说的这些都注意到了 2011-05-22 10:47:35
adslye(金币+1): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-09-26 09:11:43
这个问题我也遇到过，后来解决了。首先分离胶水封或者异丙醇封得时候不能干，也就是说分离胶和浓缩胶之间的界面不能干，这两个界面很容易有空隙，进入空气一般就会漏孔。再有就是梳子是不是太紧？梳子太紧容易造成拔梳子的时候将浓缩胶带起来，和分离胶分离了有空隙。再有就是玻板是不是新的？新的上面有一层油，要洗干净，否则，胶和板之间容易不紧，造成漏胶。我认为试剂应该没有太大问题，如果是一直使用的试剂。检查一下细节问题吧。
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7楼2011-05-21 23:23:13
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grapes

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
qiang7(金币+1): 10个孔，我每次用6个孔都会有2个左右漏，两侧的loading marker 都从来不漏 2011-05-22 10:49:31
adslye(金币+1): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-09-26 09:12:11
喔，还有一点，如果你想检查一下漏胶问题，可以现在孔里面单独点loading，让loading跑一会电泳，确定不漏胶再上样品，loading不会影响跑胶的。
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8楼2011-05-21 23:26:52
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qiang7

金虫 (小有名气)
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2楼2011-05-18 10:34:23
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qiang7

金虫 (小有名气)
但我都放了不止30min啦 TEMED加的夜不多啊5%的浓缩胶5ml加5μl多么？
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4楼2011-05-18 11:04:13
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qiang7

金虫 (小有名气)
希望大家继续提建议，问题仍没有得到解决
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5楼2011-05-21 10:21:56
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dengxuepeng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
qiang7(金币+1): 换过新的了 2011-05-22 10:46:59
adslye(金币+1): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-09-26 09:11:34
可以肯定是胶的问题，可能是pH6.8的胶缓冲液出问题了，换新的试试
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在工作中享受生活。
6楼2011-05-21 16:46:55
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叶风and花影

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by grapes at 2011-05-21 23:23:13:
这个问题我也遇到过，后来解决了。首先分离胶水封或者异丙醇封得时候不能干，也就是说分离胶和浓缩胶之间的界面不能干，这两个界面很容易有空隙，进入空气一般就会漏孔。再有就是梳子是不是太紧？梳子太紧容易造成 ...

我的梳子就很紧，每次插的时候液体都会溅出来，拔得时候也很容易把泳道弄坏掉，唉。。。有啥方法使梳子稍微松点不啊，呵呵呵
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安静的巷口~仰望幸福
10楼2011-05-22 13:02:35
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