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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western Blot电泳蛋白质外漏问题求助
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫

【答案】应助回帖

qiang7(金币+5): 谢谢您的热心，我再细细的查找一遍 2011-05-22 15:19:27
amisking(EPI+1): 2011-05-22 19:58:35
肯定是你液体配制中的问题，这是我的配方，可以参考一下。
1. 试剂配制
1.1母液
1.1.1  1.0mol/L Tris•HCl      
Tris (MW121.14)      30.29g
蒸馏水               200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH                         HCl
7.4                         约17ml
7.5                         约16m
7.6                         约15ml
8.0                         约10ml

1.1.2        1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
1.1.3        0.2mol/L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸馏水至 500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.1.4        0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO •12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸馏水至 1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.1.5        10％SDS  
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
1.1.6        10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）
1.1.7        1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14)    45.43g
超纯水             200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.1.8        0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14)     15.14g
超纯水              200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.1.9        40％Acr/Bic（37.5:1）
丙稀酰胺（Acr）         37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic）   1g
超纯水至                100ml
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
1.1.10        30％Acr/Bic（29:1）
丙稀酰胺（Acr）         29g
甲叉双丙稀酰胺（Bic）   1g
超纯水至                100ml
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
1.1.11        20％Tween20
Tween20      20ml
蒸馏水至     100ml
混匀后4℃保存。
1.2 使用液配制
1.2.1  单去污剂裂解液（PMSF）：
1mol/L Tris•HCl（pH8.0）  2.5ml
NaCl                       0.438g
TritonX-100                0.5ml
蒸馏水至                   50ml
混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
一般实际用的比较多的其实是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方：
50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。
        裂解得到的蛋白样品，由于含有较高的蛋白去垢剂干扰，不能用Brandford法测定蛋白浓度,要用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
        RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。
1.2.2  0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4       19ml
0.2 mol/L Na2HPO4       81ml
NaCl                    17g
蒸馏水至                2000ml
1.2.3        G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）
考马斯亮蓝G250     100mg
95％乙醇            50ml
磷酸                100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
1.2.4        0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44）   0.877g
蒸馏水至          100 ml
高温灭菌后，室温保存。
1.2.5  100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA                0.1g
0.15 mol/L NaCl    1ml
溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。
1.2.6  还原型5 X SDS上样缓冲液
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）         2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）      0.39g
SDS                                0.5g
溴酚蓝                              0.025
甘油                                2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
1.2.7        电泳液缓冲液
Tris（MW121.14）       3.03g
甘氨酸（MW75.07）      18.77g
SDS                    1g
蒸馏水至               1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）
1.2.8        转移缓冲液
甘氨酸（MW75.07）        2.9g
Tris（MW121.14）         5.8g
SDS                      0.37g
甲醇                     200ml
蒸馏水至                 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）
1.2.9        10X丽春红染液
丽春红S         2g
三氯乙酸         30g
磺基水杨酸       30g
蒸馏水至         100ml
使用时将其稀释10倍。
1.2.10  TBS缓冲液
1 mol/L Tris•HCl（pH7.5）     10ml
NaCl                         8.8g
蒸馏水至                     1000ml
（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
1.2.10        TBST缓冲液
20％Tween20        1.65ml
TBS                700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
1.2.11        封闭液 (最好现配现用)
脱脂奶粉（国产，光明牌）     5g
TBST                         100ml
1.2.12 洗脱抗体缓冲液（可用可不用）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇)       700 μl（通风厨里加）
SDS                                           2g
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）                      12.5ml
超纯水至                                        100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
1.2.18  40%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制
组    分        10％分离胶（两块胶，10ml）        4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水               4.85ml                            3.16ml
40％Acr/Bic（37.5:1）    2.5ml                             0.5ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 2.5ml                               －
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）  －                               1.26ml
10％ SDS              100 μl                              50 μl
10% AP                50 μl                               25μl
TEMED              5 μl                                 5 μl
*加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）
组    分          15％分离胶（两块胶，10ml）     7.8％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水                  2.34 ml                            2.065 ml
40％ Acr/Bic（37.5:1）       3.75 ml                            0.975 ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）    3.75 ml                               －
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）      －                              1.875 ml
10％ SDS                  100 μl                              50 μl
10% AP                    50 μl                               25μl
TEMED                  10μl                                5 μl


1.2.19  30%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制

        SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
*丙烯酰胺浓度（%）                          线性分离范围（kD）
15                                         12～43
10                                         16～68
7.5                                         36～94
5.0                                         57～212
*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
        配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液
溶液成分        总体积 5ml        总体积 10ml        总体积 15ml        总体积 20ml        总体积 25ml        总体积 30ml
6%         
水        2.6ml        5.3ml        7.9ml        10.6ml        13.2ml        15.9ml
30%丙烯酰胺        1.0ml        2.0ml        3.0ml        4.0ml        5.0ml        6.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        4μl        8μl        12μl        16μl        20μl        24μl
8%       
水        2.3ml        4.6ml        6.9ml        9.3ml        11.5ml        13.9ml
30%丙烯酰胺        1.3ml        2.7ml        4.0ml        5.3ml        6.7ml        8.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        3μl        6μl        9μl        12μl        15μl        18μl
10%       
水        1.9ml        4.0ml        5.9ml        7.9ml        9.9ml        11.9ml
30%丙烯酰胺        1.7ml        3.3ml        5.0ml        6.7ml        8.3ml        10.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        2μl        4μl        6μl        8μl        10μl        12μl
12%       
水        1.6ml        3.3ml        4.9ml        6.6ml        8.2ml        9.9ml
30%丙烯酰胺        2.0ml        4.0ml        6.0ml        8.0ml        10.0ml        12.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        2μl        4μl        6μl        8μl        10μl        12μl
15%       
水        1.1ml        2.3ml        3.4ml        4.6ml        5.7ml        6.9ml
30%丙烯酰胺        2.5ml        5.0ml        7.5ml        10.0ml        12.5ml        15.0ml
1.5M Tris(pH 8.8)        1.3ml        2.5ml        3.8ml        5.0ml        6.3ml        7.5ml
10% SDS        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
10%过硫酸胺        50μl        100μl        150μl        200μl        250μl        300μl
TEMED        2μl        4μl        6μl        8μl        10μl        12μl

配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液
溶液成分        总体积
3ml        总体积
4ml        总体积
5ml        总体积
6ml        总体积
8ml
水        2.1ml        2.7ml        3.4ml        4.1ml        5.5ml
30%丙烯酰胺        0.5ml        0.67ml        0.83ml        1.0ml        1.3ml
1M Tris(pH 6.8)        0.38ml        0.5ml        0.63ml        0.75ml        1.0ml
10% SDS        30μl        40μl        50μl        60μl        80μl
10%过硫酸胺        30μl        40μl        50μl        60μl        80μl
TEMED        3μl        4μl        5μl        6μl        8μl
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梦在路就在！
9楼2011-05-22 11:07:16
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[考研] 292求调剂 +4 鹅鹅鹅额额额额� 2026-03-24 4/200 2026-03-24 16:41 by peike
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