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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫

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【答案】应助回帖

qiang7(金币+5): 谢谢您的热心，我再细细的查找一遍 2011-05-22 15:19:27
amisking(EPI+1): 2011-05-22 19:58:35

肯定是你液体配制中的问题，这是我的配方，可以参考一下。
1. 试剂配制
1.1母液
1.1.1  1.0mol/L Tris•HCl
Tris (MW121.14)    30.29g
蒸馏水             200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH                      HCl
7.4                      约17ml
7.5                      约16m
7.6                      约15ml
8.0                      约10ml

1.1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
1.1.3 0.2mol/L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸馏水至 500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.1.4 0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO •12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸馏水至 1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.1.5 10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
1.1.6 10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）
1.1.7 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g
超纯水          200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.1.8 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14)    15.14g
超纯水             200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.1.9 40％Acr/Bic（37.5:1）
丙稀酰胺（Acr）       37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
超纯水至             100ml
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
1.1.10 30％Acr/Bic（29:1）
丙稀酰胺（Acr）       29g
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
超纯水至             100ml
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
1.1.11 20％Tween20
Tween20    20ml
蒸馏水至    100ml
混匀后4℃保存。
1.2 使用液配制
1.2.1  单去污剂裂解液（PMSF）：
1mol/L Tris•HCl（pH8.0）  2.5ml
NaCl                      0.438g
TritonX-100             0.5ml
蒸馏水至                50ml
混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
一般实际用的比较多的其实是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方：
50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。
裂解得到的蛋白样品，由于含有较高的蛋白去垢剂干扰，不能用Brandford法测定蛋白浓度,要用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。
1.2.2  0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4    19ml
0.2 mol/L Na2HPO4    81ml
NaCl                   17g
蒸馏水至             2000ml
1.2.3 G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）
考马斯亮蓝G250    100mg
95％乙醇          50ml
磷酸             100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
1.2.4 0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44） 0.877g
蒸馏水至       100 ml
高温灭菌后，室温保存。
1.2.5  100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA             0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。
1.2.6  还原型5 X SDS上样缓冲液
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）       2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）    0.39g
SDS                               0.5g
溴酚蓝                            0.025
甘油                               2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
1.2.7 电泳液缓冲液
Tris（MW121.14）    3.03g
甘氨酸（MW75.07）    18.77g
SDS                   1g
蒸馏水至             1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）
1.2.8 转移缓冲液
甘氨酸（MW75.07）       2.9g
Tris（MW121.14）       5.8g
SDS                   0.37g
甲醇                   200ml
蒸馏水至                1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）
1.2.9 10X丽春红染液
丽春红S       2g
三氯乙酸       30g
磺基水杨酸    30g
蒸馏水至       100ml
使用时将其稀释10倍。
1.2.10  TBS缓冲液
1 mol/L Tris•HCl（pH7.5）    10ml
NaCl                      8.8g
蒸馏水至                   1000ml
（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
1.2.10 TBST缓冲液
20％Tween20       1.65ml
TBS             700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
1.2.11 封闭液 (最好现配现用)
脱脂奶粉（国产，光明牌）    5g
TBST                      100ml
1.2.12 洗脱抗体缓冲液（可用可不用）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇)    700 μl（通风厨里加）
SDS                                        2g
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）                   12.5ml
超纯水至                                     100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
1.2.18  40%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制
组分       10％分离胶（两块胶，10ml）       4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水             4.85ml                         3.16ml
40％Acr/Bic（37.5:1） 2.5ml                            0.5ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 2.5ml                            －
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）  －                            1.26ml
10％ SDS             100 μl                            50 μl
10% AP             50 μl                            25μl
TEMED             5 μl                               5 μl
*加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）
组分       15％分离胶（两块胶，10ml）    7.8％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水                2.34 ml                         2.065 ml
40％ Acr/Bic（37.5:1）    3.75 ml                         0.975 ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 3.75 ml                            －
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）    －                            1.875 ml
10％ SDS                100 μl                            50 μl
10% AP                   50 μl                            25μl
TEMED                10μl                               5 μl

1.2.19  30%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
*丙烯酰胺浓度（%）                         线性分离范围（kD）
15                                        12～43
10                                        16～68
7.5                                        36～94
5.0                                        57～212
*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液
溶液成分总体积 5ml 总体积 10ml 总体积 15ml 总体积 20ml 总体积 25ml 总体积 30ml
6%
水 2.6ml 5.3ml 7.9ml 10.6ml 13.2ml 15.9ml
30%丙烯酰胺 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml 5.0ml 6.0ml
1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml
10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
10%过硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
TEMED 4μl 8μl 12μl 16μl 20μl 24μl
8%
水 2.3ml 4.6ml 6.9ml 9.3ml 11.5ml 13.9ml
30%丙烯酰胺 1.3ml 2.7ml 4.0ml 5.3ml 6.7ml 8.0ml
1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml
10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
10%过硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
TEMED 3μl 6μl 9μl 12μl 15μl 18μl
10%
水 1.9ml 4.0ml 5.9ml 7.9ml 9.9ml 11.9ml
30%丙烯酰胺 1.7ml 3.3ml 5.0ml 6.7ml 8.3ml 10.0ml
1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml
10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
10%过硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl
12%
水 1.6ml 3.3ml 4.9ml 6.6ml 8.2ml 9.9ml
30%丙烯酰胺 2.0ml 4.0ml 6.0ml 8.0ml 10.0ml 12.0ml
1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml
10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
10%过硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl
15%
水 1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml
30%丙烯酰胺 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml
1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml
10% SDS 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
10%过硫酸胺 50μl 100μl 150μl 200μl 250μl 300μl
TEMED 2μl 4μl 6μl 8μl 10μl 12μl

配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液
溶液成分总体积
3ml 总体积
4ml 总体积
5ml 总体积
6ml 总体积
8ml
水 2.1ml 2.7ml 3.4ml 4.1ml 5.5ml
30%丙烯酰胺 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml
1M Tris(pH 6.8) 0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml 1.0ml
10% SDS 30μl 40μl 50μl 60μl 80μl
10%过硫酸胺 30μl 40μl 50μl 60μl 80μl
TEMED 3μl 4μl 5μl 6μl 8μl