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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blot 求助，请高手指点一下
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Fire0304

银虫 (小有名气)

[求助] western blot 求助，请高手指点一下

初次做western blot，蛋白分子量是57kD，
    第一次试验：浓缩胶4% 80V，分离胶10%，100V， PVDF膜转膜300mA 60min，丽春红染色无条带，封闭2h，一抗1:300，内参抗体1:500,4°C过夜，二抗1:2000,室温1h
     结果：目的蛋白6条带均出现，但不清晰，内参条带未见，多次压片结果同上。
    第二次试验：浓缩胶4%，40V，分离胶10%，85V，PVDF膜转膜250mA 80min，用上次及新配的一抗、内参抗体、二抗，余条件不变。
    结果：目的蛋白条带均未见。内参条带出现，但不清晰。多次压片结果同上。用考马斯亮蓝染胶未见蛋白条带。
    第三次实验：浓缩胶4%，30V，分离胶10%，60V，其余均与第二次实验条件相同，结果什么都没有看到，过后考马斯亮蓝染胶、染膜均可见清晰蛋白条带，但条带聚集较紧凑。
    分析：第一次实验有结果，但内参未见，第二次实验无结果，但可见内参一，用的是新旧一抗，内参抗体及二抗，第三次实验无结果，抗体同前，考虑一抗出现问题。
考马斯亮蓝染胶、染膜均可见清晰蛋白条带，但条带聚集较紧凑，考虑胶浓度过大。
     请各位高手指点一下，让小弟可顺利完成实验。。。。谢谢
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1楼2011-08-12 22:06:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
帮顶下！
周末人少，耐心等等吧！
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2楼2011-08-13 00:38:43
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-08-13 15:46:50
告诉我一抗抗体是哪个公司的？我的条件浓缩胶5%，40V，分离胶10%。70V。转膜100ma。2.5小时。封闭2h。一抗37°2小时（santa抗体）。二抗37°一小时。结果相当好。
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3楼2011-08-13 09:25:34
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

补充，1:500一抗体。二抗1；1000。（碧云天二抗）
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4楼2011-08-13 09:27:14
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晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 问得好 2011-08-13 15:47:05
丽春红染色无条带，怎么后面还做出目的条带了？难道用丽春红染色的胶而不是PVDF的膜？
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人有绝交，才有至交！
5楼2011-08-13 14:26:32
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good 2011-08-14 09:09:32
Fire0304(金币+5): 有帮助，实验后来算是成功了 2011-11-09 00:01:48
引用回帖:
1楼: Originally posted by Fire0304 at 2011-08-12 22:06:32:
初次做western blot，蛋白分子量是57kD，
    第一次试验：浓缩胶4% 80V，分离胶10%，100V， PVDF膜转膜300mA 60min，丽春红染色无条带，封闭2h，一抗1:300，内参抗体1:500,4°C过夜，二抗1:2000,室温1h
     结 ...

前后几次试验的page胶配制情况是否稳定？为何要不停的降低电压？
丽春红有时候不够敏感，染不出来的时候也不能确定就一定没转到膜上
丽春红能染上肯定是电泳和转膜都很不错了。
像你这种情况其实可以分别做2块胶，转2块膜，分别用第一次和第二次转膜的条件来做目的片段和内参。
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How about the future？
6楼2011-08-13 22:09:51
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Fire0304

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2011-08-13 09:25:34:
告诉我一抗抗体是哪个公司的？我的条件浓缩胶5%，40V，分离胶10%。70V。转膜100ma。2.5小时。封闭2h。一抗37°2小时（santa抗体）。二抗37°一小时。结果相当好。

我也是santa抗体，抗体放久了影响大吗，因为是师姐去年留下的，B-actin和二抗也是同时期的，昨天又做了一次，目的蛋白没显示出条带，但B-actin较好显示出。
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7楼2011-08-15 19:49:20
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Fire0304

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by w2boluo at 2011-08-13 22:09:51:
前后几次试验的page胶配制情况是否稳定？为何要不停的降低电压？
丽春红有时候不够敏感，染不出来的时候也不能确定就一定没转到膜上
丽春红能染上肯定是电泳和转膜都很不错了。
像你这种情况其实可以分别做2块 ...

之前配胶的溶液貌似PH不对，重新调整了一次，再做一次，结果目的蛋白还是没有，内参较清晰，一抗浓度调整到1：200，因为抗体是旧的，现在考虑一抗问题，但二抗和内参抗体都是同一时期的。。。。纠结啊，只剩下10天左右的时间啦。。。。晚上继续奋斗
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8楼2011-08-15 19:54:41
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by Fire0304 at 2011-08-15 19:49:20:
我也是santa抗体，抗体放久了影响大吗，因为是师姐去年留下的，B-actin和二抗也是同时期的，昨天又做了一次，目的蛋白没显示出条带，但B-actin较好显示出。

抗体是冻住的还是放4度的？不管是哪种，用之前最好离下心。避免反复冻融，最好分装了放-70度
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How about the future？
9楼2011-08-15 20:01:08
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