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yananjizhu

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】westernblot已有5人参与

各位虫友：
      大家好，想问下做westernblot时上样量一样，为什么最后显色时条带的宽窄和明暗不一样呢，是抗体假的不均匀，还是转膜时转到膜上的量就不一样，或者还有其他的原因，谢谢指教
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1楼2011-04-09 17:58:29
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ujsyangyong

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+5): 鼓励交流。很细致很专业。 2011-04-10 11:45:52
西瓜(EPI+1): 鼓励！ 2011-04-10 14:55:29
这要看你每个泳道所上蛋白样品中目的蛋白的表达量是否存在差异，如果确实存在差异，那么出现这种结果就是完全正常的。不过需要排除由于上样、转膜、孵育抗体以及显色不均匀带来的影响。我Wersternblot做过很多，总结了一些经验，将上述步骤中可能产生偏差的解决方法总结如下：
上样：上样前先测定蛋白浓度，根据每泳道上样蛋白总量相等的原则计算上样体积，最好先染内参验证一下是否每泳道一致。
转膜：确保胶与膜之间平整接触，不要留有气泡，滤纸要平整光滑，在胶上盖膜的时候，将膜用转膜缓冲液浸湿，采用平推的方式可以避免气泡产生。
孵育抗体：膜不要太大，能覆盖目的条带的最小面积就可以了，孵育抗体的时候最好是将膜完整的泡在抗体稀释液中（比较烧钱，国内一般都不会这么做），我们是用封口膜绷在96孔板上，然后将抗体加在封口膜上，依靠液体的表面张力，会形成露珠状，然后将封闭后的膜用滤纸吸干（一定要吸干），将蛋白面反扣在抗体稀释液上，避免抗体跑到膜的背面，这样整张膜就完全漂浮在抗体上，如果抗体跑到膜的反面，则膜可能由于重量沉下去，与封口膜紧贴，紧贴部分抗体孵育就不足，当然就会产生条带染色较浅的现象了。
加发光剂：方法同加抗体，也可以蛋白面朝上，将发光剂滴加在膜表面，对着光看一下是不是整张膜都被发光剂覆盖了。
其中抗体孵育缓解是最容易对结果产生影响的，主要注意以下三点：
1.在允许的情况下尽量减少膜的面积，减轻膜的自重和抗体用量
2.还有上抗体前将膜吸干可以避免抗体跑到膜的背面
3.抗体量不能太少，一般25平方厘米的膜抗体稀释液用量在1.5ml左右
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实验，实验，还是实验！
2楼2011-04-10 11:33:10
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75372017

木虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-10 19:23:59
引用回帖:
Originally posted by ujsyangyong at 2011-04-10 11:33:10:
这要看你每个泳道所上蛋白样品中目的蛋白的表达量是否存在差异，如果确实存在差异，那么出现这种结果就是完全正常的。不过需要排除由于上样、转膜、孵育抗体以及显色不均匀带来的影响。我Wersternblot做过很多，总 ...

孵育抗体的时候最好是将膜完整的泡在抗体稀释液中（比较烧钱，国内一般都不会这么做），

我就是这么做的，一般取10ml抗体稀释液浸泡膜，然后再水平摇床上摇。。。
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3楼2011-04-10 17:34:49
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 75372017 at 2011-04-10 17:34:49:
孵育抗体的时候最好是将膜完整的泡在抗体稀释液中（比较烧钱，国内一般都不会这么做），

我就是这么做的，一般取10ml抗体稀释液浸泡膜，然后再水平摇床上摇。。。

我们也是   一抗重复用
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4楼2011-04-10 18:24:36
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yananjizhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by linyingjia at 2011-04-10 18:24:36:
我们也是   一抗重复用

我想问下一抗重复利用多少次  谢谢指教
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5楼2011-04-11 17:45:21
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yananjizhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 75372017 at 2011-04-10 17:34:49:
孵育抗体的时候最好是将膜完整的泡在抗体稀释液中（比较烧钱，国内一般都不会这么做），

我就是这么做的，一般取10ml抗体稀释液浸泡膜，然后再水平摇床上摇。。。

我想问下一抗可以重复利用多少次  谢谢指教
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6楼2011-04-11 17:46:18
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yananjizhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ujsyangyong at 2011-04-10 11:33:10:
这要看你每个泳道所上蛋白样品中目的蛋白的表达量是否存在差异，如果确实存在差异，那么出现这种结果就是完全正常的。不过需要排除由于上样、转膜、孵育抗体以及显色不均匀带来的影响。我Wersternblot做过很多，总 ...

谢谢 我的分子量是180  你有没遇到过这么大分子量的 我的转膜时间是3.5h，会不会有点过长  条带跑出来也不很均匀 改怎么修正 请指教 谢谢您
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7楼2011-04-11 17:49:15
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by yananjizhu at 2011-04-11 17:45:21:
我想问下一抗重复利用多少次  谢谢指教

我们这用到长菌……
老板说他在国外时，长了菌的话，离心把菌甩到下面，取上面的继续用……
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8楼2011-04-11 18:03:13
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+2): 是滴 2011-04-11 18:07:25
引用回帖:
Originally posted by yananjizhu at 2011-04-11 17:45:21:
我想问下一抗重复利用多少次  谢谢指教

一般两三次吧   看情况    用的时候可以补加少量的抗体
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9楼2011-04-11 18:06:15
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ujsyangyong

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by linyingjia at 2011-04-11 18:06:15:
一般两三次吧   看情况    用的时候可以补加少量的抗体

我觉得这样实验条件不好控制，还是用封口膜孵抗体比较节省，而且实验结果稳定。
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实验，实验，还是实验！
10楼2011-04-11 22:37:20
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