| 查看: 2287 | 回复: 10 | |||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
[交流]
【求助/交流】westernblot 已有5人参与
|
|||
|
各位虫友： 大家好，想问下做westernblot时上样量一样，为什么最后显色时条带的宽窄和明暗不一样呢，是抗体假的不均匀，还是转膜时转到膜上的量就不一样，或者还有其他的原因，谢谢指教 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有224人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于western blot的小问题
已经有12人回复
- 提供Western blot技术服务
已经有63人回复
- western blot 请教
已经有10人回复
- western blot 求助，请高手指点一下
已经有8人回复
- 关于western blot转膜
已经有20人回复
- 新手求助western blot
已经有22人回复
- 【分享】新手上路 Western blot问题集合
已经有6人回复
- 【求助/交流】western blot
已经有35人回复
- 【求助/交流】westernblot的背景怎么消除呀
已经有10人回复
- 【求助/交流】有关western-blot的一些问题
已经有18人回复
ujsyangyong
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 157 (高中生)
- 金币: 12087.9
- 红花: 6
- 帖子: 1002
- 在线: 134.7小时
- 虫号: 471632
- 注册: 2007-12-02
- 性别: GG
- 专业: 脑、脊髓、周围神经损伤及
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+5): 鼓励交流。很细致很专业。 2011-04-10 11:45:52
西瓜(EPI+1): 鼓励！ 2011-04-10 14:55:29
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+5): 鼓励交流。很细致很专业。 2011-04-10 11:45:52
西瓜(EPI+1): 鼓励！ 2011-04-10 14:55:29
|
这要看你每个泳道所上蛋白样品中目的蛋白的表达量是否存在差异，如果确实存在差异，那么出现这种结果就是完全正常的。不过需要排除由于上样、转膜、孵育抗体以及显色不均匀带来的影响。我Wersternblot做过很多，总结了一些经验，将上述步骤中可能产生偏差的解决方法总结如下： 上样：上样前先测定蛋白浓度，根据每泳道上样蛋白总量相等的原则计算上样体积，最好先染内参验证一下是否每泳道一致。 转膜：确保胶与膜之间平整接触，不要留有气泡，滤纸要平整光滑，在胶上盖膜的时候，将膜用转膜缓冲液浸湿，采用平推的方式可以避免气泡产生。 孵育抗体：膜不要太大，能覆盖目的条带的最小面积就可以了，孵育抗体的时候最好是将膜完整的泡在抗体稀释液中（比较烧钱，国内一般都不会这么做），我们是用封口膜绷在96孔板上，然后将抗体加在封口膜上，依靠液体的表面张力，会形成露珠状，然后将封闭后的膜用滤纸吸干（一定要吸干），将蛋白面反扣在抗体稀释液上，避免抗体跑到膜的背面，这样整张膜就完全漂浮在抗体上，如果抗体跑到膜的反面，则膜可能由于重量沉下去，与封口膜紧贴，紧贴部分抗体孵育就不足，当然就会产生条带染色较浅的现象了。 加发光剂：方法同加抗体，也可以蛋白面朝上，将发光剂滴加在膜表面，对着光看一下是不是整张膜都被发光剂覆盖了。 其中抗体孵育缓解是最容易对结果产生影响的，主要注意以下三点： 1.在允许的情况下尽量减少膜的面积，减轻膜的自重和抗体用量 2.还有上抗体前将膜吸干可以避免抗体跑到膜的背面 3.抗体量不能太少，一般25平方厘米的膜抗体稀释液用量在1.5ml左右 |
2楼2011-04-10 11:33:10
3楼2011-04-10 17:34:49
linyingjia
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 105 (高中生)
- 贵宾: 0.139
- 金币: 24730.4
- 散金: 1
- 红花: 22
- 帖子: 3968
- 在线: 234.5小时
- 虫号: 668860
- 注册: 2008-12-05
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
4楼2011-04-10 18:24:36
5楼2011-04-11 17:45:21
6楼2011-04-11 17:46:18
7楼2011-04-11 17:49:15
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
8楼2011-04-11 18:03:13
linyingjia
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 105 (高中生)
- 贵宾: 0.139
- 金币: 24730.4
- 散金: 1
- 红花: 22
- 帖子: 3968
- 在线: 234.5小时
- 虫号: 668860
- 注册: 2008-12-05
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
9楼2011-04-11 18:06:15
ujsyangyong
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 157 (高中生)
- 金币: 12087.9
- 红花: 6
- 帖子: 1002
- 在线: 134.7小时
- 虫号: 471632
- 注册: 2007-12-02
- 性别: GG
- 专业: 脑、脊髓、周围神经损伤及
10楼2011-04-11 22:37:20
5