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烂铁

金虫 (小有名气)

[交流] 关于western blot转膜

最近开始做western blot，但是转膜这一步总是不成功，我用的是半干式转膜法，180mA和1h左右，100mA1.5h都试过了，根据转膜仪上面得说明，转膜时间已经足够了，可是丽春红染色后还是没有条带。
我用的滤纸是普通的滤纸（不是3mm滤纸），这会有影响么？另外我用的PVDF膜已经有一段时间了，这个会不会存在过期的问题？
希望大家帮助，谢谢！！
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1楼 2011-05-09 10:51:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

noah1020

新虫 (小有名气)
★
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烂铁(金币+5): 2011-05-17 08:55:13
LZ的目的蛋白分子量是多少啊？转膜时间是根据分子量来订的~如果分子量小于20kD的话，转膜时间要很短，不然蛋白就透过去了；蛋白分子量要是大于80的话，要适当的延长转膜时间，要不转膜不完全~还有可能就是在转膜的过程中由于产生了大量的热，导致蛋白降解~一般我转膜的时候都在下面放一盆冰来降温~要不就把转膜槽放到冰箱冷藏室里，降低电压延长转膜时间~
一般蛋白上样量够的话，丽春红染10min应该可以看到条带~
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11楼2011-05-13 12:55:18
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普通回帖

elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你的膜活化了吗？
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2楼2011-05-09 11:57:24
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烂铁

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by elvias at 2011-05-09 11:57:24:
你的膜活化了吗？

恩，先用甲醇浸泡，然后用转膜缓冲液浸泡的
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3楼2011-05-09 12:01:16
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
烂铁(金币+5): 2011-05-09 14:19:25
西瓜(金币+3): 热心噢 2011-05-09 17:55:41
引用回帖:
Originally posted by 烂铁 at 2011-05-09 12:01:16:
恩，先用甲醇浸泡，然后用转膜缓冲液浸泡的

那你有没有预染marker，你可以用一下，看看是否是转膜这步出了问题。
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4楼2011-05-09 12:29:58
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
烂铁(金币+5): 2011-05-09 14:14:51
西瓜(金币+5, EPI+1): 厉害的新虫噢！偶注意你很久了！ 2011-05-09 17:57:58
做western blot，一般都是用预染Marker，转膜后如果膜上maker条带清晰的话，你要的蛋白样品一般都会转上的。用丽春红染不上色，很有可能是你样品蛋白含量比较少，条带不清晰，如果你的一抗效价比较高的话，同样能显出条带；还有一种可能就是你用的丽春红溶液用的次数过多，不好用了，如果是这种情况，建议新配一些丽春红染液试一下，不方便的话继续往下做就可以，看看最后结果再说。希望对楼主有所帮助！
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5楼2011-05-09 13:02:50
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
烂铁(金币+5): 2011-05-09 14:15:02
西瓜(金币+3): 很有经验 2011-05-09 17:58:40
引用回帖:
Originally posted by shenhaiwang at 2011-05-09 13:02:50:
做western blot，一般都是用预染Marker，转膜后如果膜上maker条带清晰的话，你要的蛋白样品一般都会转上的。用丽春红染不上色，很有可能是你样品蛋白含量比较少，条带不清晰，如果你的一抗效价比较高的话，同样能 ...

滤纸应该不会有很大影响，我们实验室也是用这样的滤纸，膜一般不会过期，放置条件好的话，可以放好几年的。
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6楼2011-05-09 13:06:53
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烂铁

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by elvias at 2011-05-09 12:29:58:
那你有没有预染marker，你可以用一下，看看是否是转膜这步出了问题。

没有用过预染marker
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7楼2011-05-09 14:17:13
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我们是湿转   表示压力不大
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8楼2011-05-09 21:42:52
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如来神掌

捐助贵宾 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
烂铁(金币+5): 2011-05-11 09:15:19
滤纸的影响不会很大。
按照前面的建议，最好用预染Marker试试。

估计你的目的蛋白含量太小了。
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9楼2011-05-10 12:57:34
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whiskyxy

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
用预染Marker做阳性对照，如果转成功的话能明显的看到在膜上有Marker的。
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10楼2011-05-10 14:03:51
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烂铁

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by noah1020 at 2011-05-13 12:55:18:
LZ的目的蛋白分子量是多少啊？转膜时间是根据分子量来订的~如果分子量小于20kD的话，转膜时间要很短，不然蛋白就透过去了；蛋白分子量要是大于80的话，要适当的延长转膜时间，要不转膜不完全~还有可能就是在转膜的 ...

蛋白从20多到100多都有啊，我的目的蛋白是66kD，但是转完后膜上面一条带都没有，干干净净的，这就不是蛋白大小的问题了吧，如果干转的话，一般电流设置多大啊？我的是干转，需要加冰冷却么？
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12楼2011-05-17 08:57:55
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noah1020

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 烂铁 at 2011-05-17 08:57:55:
蛋白从20多到100多都有啊，我的目的蛋白是66kD，但是转完后膜上面一条带都没有，干干净净的，这就不是蛋白大小的问题了吧，如果干转的话，一般电流设置多大啊？我的是干转，需要加冰冷却么？

要是干转的话，一般可以不加冰的~如果恒流没有做出来条带，那就建议你使用恒压法试试~我转膜的时候恒流是200mA，恒压就用60V~适当延长转膜时间~我当时做40kD蛋白时候，转膜时间到3h都可以的~
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13楼2011-05-17 11:31:13
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lavender169

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我们是15v  35min
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14楼2011-05-17 11:33:09
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noah1020

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励！ 2011-05-17 16:55:54
引用回帖:
Originally posted by 烂铁 at 2011-05-17 08:57:55:
蛋白从20多到100多都有啊，我的目的蛋白是66kD，但是转完后膜上面一条带都没有，干干净净的，这就不是蛋白大小的问题了吧，如果干转的话，一般电流设置多大啊？我的是干转，需要加冰冷却么？

突然想起来，你的蛋白时66kD的话，你用180mA转1h貌似是转不过去的~加大电流，并且延长时间~你试试200mA转膜2h
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15楼2011-05-17 11:33:10
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
电极有没有放反啊？
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16楼2012-01-13 07:32:42
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wulelexinhun

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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8楼: Originally posted by linyingjia at 2011-05-09 21:42:52
我们是湿转   表示压力不大

请问一下，你们180KDa的蛋白用湿转条件是怎样的？多少伏或多少mA转多长时间？跪求
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17楼2013-05-23 19:05:59
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by wulelexinhun at 2013-05-23 19:05:59
请问一下，你们180KDa的蛋白用湿转条件是怎样的？多少伏或多少mA转多长时间？跪求...

湿转   250ma   3h   新配的转膜液    我们的是大的转膜仪
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18楼2013-05-23 19:25:50
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723小不点儿

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我是新手，请问一下80kd的蛋白转膜的条件大约是多少啊，200ma，2小时可以吗
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19楼2013-11-15 23:30:46
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723小不点儿

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
转膜的时候，膜总是有的地方变黑怎么回事，并且需要用的东西都是干净的
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20楼2013-11-15 23:32:50
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by noah1020 at 2011-05-13 12:55:18
LZ的目的蛋白分子量是多少啊？转膜时间是根据分子量来订的~如果分子量小于20kD的话，转膜时间要很短，不然蛋白就透过去了；蛋白分子量要是大于80的话，要适当的延长转膜时间，要不转膜不完全~还有可能就是在转膜的过 ...

请问，，WB   转膜   时  电流  时间，，，   要根据  膜的大小，分子量 来定的吗？  具体的 能说一下吗？  谢谢谢谢
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21楼2014-04-10 10:44:25
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