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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于western blot的一两个实验疑问。
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a83875785

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 关于western blot的一两个实验疑问。

1.我的二抗是驴抗羊，洗二抗1小时后发现背景还是很深，这时我能把膜再拿回来，重新多洗1小时，再加ecl曝光显色吗？
2.第二个问题是：二抗本来是室温下侧摆摇床孵育2h的，可是别人占用着，这时我放到4度的冰箱的摇床上孵育，得孵育多久？
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1楼 2011-06-11 11:59:27
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a83875785

铁杆木虫 (著名写手)
怎么没人 沉了吗
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2楼2011-06-13 17:46:17
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火神000

金虫 (小有名气)
也遇到过这样的问题，寻求帮助Ing
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生活不知眼前的苟且，还有诗和远方
3楼2011-06-14 11:39:15
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-06-14 18:23:14
引用回帖:
Originally posted by a83875785 at 2011-06-11 11:59:27:
1.我的二抗是驴抗羊，洗二抗1小时后发现背景还是很深，这时我能把膜再拿回来，重新多洗1小时，再加ecl曝光显色吗？
2.第二个问题是：二抗本来是室温下侧摆摇床孵育2h的，可是别人占用着，这时我放到4度的冰箱的摇 ...

1.背景很黑是不是二抗加多了，可以减少2二抗比例试下。
2,摇床很小吗，为什么不能放一起摇那？放四度到时可以过夜来着，但是觉得室温下摇1-2H就足够了。
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4楼2011-06-14 14:42:01
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
silicare(金币+1): 第一次听说 2011-06-14 18:23:39
a83875785(金币+1): 2011-06-14 21:34:09
抗羊的二抗天生背景黑，没办法，尽量避免羊的一抗。最好显影后放几个小时，全部淬灭后再重新显影。4度孵育的话几个小时够了。
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5楼2011-06-14 15:07:16
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jsk10

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-06-14 18:25:10
a83875785(金币+1): 2011-06-14 21:34:14
1、多洗是没用的，抗体已牢牢吸附在膜上了，解决办法是转膜后进行封闭时，封封闭液浓度稍微加大，或延长封闭时间，使封闭更完全；降低二抗浓度或二抗孵育时间。
2、二抗孵育即使在室温下也不需要太长时间的，我们做的话室温或37度30min即可，最多1h，要是4度的话可适当延长时间，2h也是足够可以了。
   以上为本人实验室条件下的情况及参数，希望有帮助。
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互相帮助！
6楼2011-06-14 18:09:59
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子曰包子好吃

银虫 (小有名气)
你用什么洗的啊  我这里是TBST 3次 每次10min  还有二抗浓度适当降低 封闭时间延长到2-3个小时（我这里是）显影定影时间调整下会有很大改观
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7楼2011-07-16 10:26:33
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