应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western blot
361/1返回列表
查看: 6416  |  回复: 35
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

雪人也怕冷

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】western blot

求助：转膜后，丽春红染色条带很明显，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST洗三次，二抗（TBST稀释0.5--1000），涂AB液，显色后为白板，什么条带都没有。是哪里出了问题？是不是没有曝光就说明显影定影液没问题？AB液刚买的新的，也应该没问题，高手帮分析分析啊，谢谢啦'
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-03-18 16:15:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenyyy

无虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
转膜时间久了？
回复此楼
2楼2011-03-18 17:14:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hwlightning

铜虫 (初入文坛)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
丽春红染色害人
回复此楼
3楼2011-03-18 17:54:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冬虫夏草1

金虫 (小有名气)
★ ★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:39:08
雪人也怕冷(金币+1): 2011-03-22 11:13:37
你是不应该有两块胶，一块儿用于染色观察条带是否明显且有无特异带。第二块儿用于转膜杂交，确定杂交信号。
现在是你的杂交结果没信号，若排除显色问题，就是你的跑胶或转膜出了披露。
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2011-03-18 22:09:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1992xlliu

金虫 (小有名气)
★ ★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:39:18
估计洗丽春红的过程中蛋白被洗掉了。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2011-03-18 22:44:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

libin051mail

铜虫 (初入文坛)
★ ★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:39:14
雪人也怕冷(金币+1): 2011-03-22 11:13:55
首先考虑一抗是否合理
其次二抗是否抗一抗
赞一下(2人) 回复此楼
7楼2011-03-18 23:17:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jjwl_rscn

金虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
走过路过不要错过
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-03-19 15:10:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenlang007

木虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
雪人也怕冷(金币+1): 2011-03-22 11:14:03
蛋白浓度如何？actin呢
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2011-03-19 16:56:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
做实验一定要做阳性对照，向别人要曾经做出来的蛋白来确定是不是操作问题；再试试一抗37度1.5—2h；混合二抗和AB液，暗室看是否有荧光
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2011-03-21 20:46:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

paulpaulzj

至尊木虫 (知名作家)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
转膜过了好像可以排除。
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-03-21 20:51:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ls2046

铁杆木虫 (职业作家)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
纯学习，，，
回复此楼
13楼2011-03-21 22:56:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qingyuansw20

金虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
雪人也怕冷(金币+2): 谢谢 2011-03-22 11:16:24
1.转膜后直接封闭，不要染什么色了。
2.1抗2抗封闭蛋白面要向下（无论你用什么方法），还不能漏出一抗二抗。
3.1抗要4°过夜效果更好。
4.内参出条带了吗？内参要是出了。就是你1抗问题，浓度低了。来个1:200试试吧。
5.做wb要看运气的。
赞一下(1人) 回复此楼
15楼2011-03-21 23:19:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sai00fuji

金虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
帮顶。。。。。。
回复此楼
16楼2011-03-22 09:20:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

meiying3061

木虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
建议做个不染色的胶的对照，曝一下内参看看
赞一下(1人) 回复此楼
17楼2011-03-22 09:27:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

雪人也怕冷

铜虫 (初入文坛)

谢谢各位帮忙

我已经找到问题，并解决掉啦，一抗用的太少，造成虹吸现象，没有孵上
赞一下 回复此楼
19楼2011-03-22 11:15:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
一步一步排除吧
回复此楼
20楼2011-03-22 12:20:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

believemin

金虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
恩  有可能是洗去丽春红染液时把蛋白洗没了，要不就是一抗二抗的浓度再调一下，，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST？这么说你弄了三天？其实封闭不用那么长时间的，37度一到两小时就可以了
赞一下(1人) 回复此楼
21楼2011-03-22 16:10:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lavender169

木虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
你这个信息太少 转膜用的哪种方法 多久？ 你5%的奶粉封闭也过夜？  你显色多久？AB夜是普通的还是加强型的？
赞一下(1人) 回复此楼
22楼2011-03-29 13:49:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lavender169

木虫 (正式写手)
你这个信息太少 转膜用的哪种方法 多久？ 你5%的奶粉封闭也过夜？  你显色多久？AB夜是普通的还是加强型的？
赞一下 回复此楼
23楼2011-03-29 13:53:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

terry130

木虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
最好不要5%milk过夜，一定要那样的话也必须是新配的milk在冷室过夜。奶粉一旦变质就很难洗掉并且会极大地破坏一抗的识别能力。另外做western是要加loading control的，比如ACTIN或者GAPDH之类的，如果这些蛋白的条带都有的话就不是western技术和显影的问题。你不带loading control的话即使出来带也不能证明什么的。
立春红染色原则上是可以在block之前做的，这样做的目的是为了先确认一下，但这样做的后果往往被我们怀疑，虽然我们找不到合理的解释。其实转膜失败的概率是很低的，如果不是很心疼抗体的话，完全可以不染色直接做到曝光，曝光后没有条带的话可以回头怀疑转膜效果，这个时候把曝光后的片子用清水冲一冲然后染色一样可以确认转膜效果。而这样颠倒之后就不必担心染色对抗体特异性的潜在威胁了。
赞一下(1人) 回复此楼
24楼2011-03-29 15:20:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zjdzhang

禁虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
本帖内容被屏蔽
25楼2011-04-06 12:21:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

314300420

捐助贵宾 (著名写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 雪人也怕冷 at 2011-03-18 16:15:26:
求助：转膜后，丽春红染色条带很明显，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST洗三次，二抗（TBST稀释0.5--1000），涂AB液，显色后为白板，什么条带都没有。是哪里出了问题？是不是没有曝光就说 ...

楼主做的是纯化后的蛋白WB检测还是从细胞提取的总蛋白？要是纯化后的蛋白，立春红染色能看见明显的条带，再用WB检测，这个上样量就太大了，0.1~0.5ug就足够了，最后曝光为白板，我分析认为是上样量太大，结合的一抗、二抗过多，最后加显色液时大量的二抗迅速将底物消耗掉，等你曝光时因底物已消耗完了，荧光消失，所以才会白板，若使用的显色液为ECL这样的发光液，不妨再加完ECL之后将灯关掉，在黑暗的环境中观察是否有荧光，若是有而且很亮，基本上就是我说的这种情况了，或者显影液不行了，要是没有荧光可以考虑一抗是否可以识别你的抗原的问题了。
赞一下(1人) 回复此楼
26楼2011-04-12 15:55:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fjj5d20

金虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
你跑的是什么蛋白  容易出不容易 如果容易出的 没出来 则要找找western系统的原因了 但是 如果蛋白本来表达量就很低 不容易出 那就改变条件再跑
赞一下(1人) 回复此楼
27楼2011-04-17 16:19:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Mingn1

金虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
看别人做，自己没做过，帮不上忙
赞一下(1人) 回复此楼
28楼2011-04-17 16:30:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luohuacheng

新虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
一般就是一抗二抗的问题。另外，封闭不需要过夜吧。如果实在不行，可以先检测二抗是否可行。就是看二抗和AB液反应，是否存在荧光。
赞一下(1人) 回复此楼
29楼2011-04-27 21:59:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
帮顶
回复此楼
30楼2011-04-28 12:43:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
我觉得一抗和二抗出了问题
赞一下(1人) 回复此楼
31楼2011-04-28 13:11:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

juanjuan11

金虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
你的抗体效价怎么样啊？ 若一般，可能是一抗二抗浓度太小了
赞一下(1人) 回复此楼
32楼2011-04-28 15:29:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

河外生命

木虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
l丽春红染色是不会有问题的。我们实验室每次都是要用丽春红染色确认一下蛋白是否转上。之后用TBST洗一下就可以。
感觉你的情况跟我们实验室有段时间的情况很相似，就是发光时可以很明显的看到膜上的荧光，就是曝光后，胶片上什么都没有，是张白片。当时我们就觉得显影液有问题，后来换了新的显影液，果然没再出现那种状况。试下更换新的显影液吧。
赞一下(1人) 回复此楼
33楼2011-04-28 15:35:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaotao1985

新虫 (初入文坛)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
??
回复此楼
34楼2011-04-30 23:12:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leilaye

铜虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
15楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2011-03-21 23:19:15:
1.转膜后直接封闭，不要染什么色了。
2.1抗2抗封闭蛋白面要向下（无论你用什么方法），还不能漏出一抗二抗。
3.1抗要4°过夜效果更好。
4.内参出条带了吗？内参要是出了。就是你1抗问题，浓度低了。来个1:200试 ...

对于2，蛋白面向下会不会摇床摇得把蛋白磨掉了，我之前都是向上 可以做出来。。。。。。。。。。。。不过最近没有条带，运气衰死了。。
赞一下 回复此楼
35楼2012-02-16 11:03:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jl860822

金虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1): 谢谢参与
我的目前也是这个情况，求高手指点
赞一下 回复此楼
36楼2012-07-09 12:16:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
weishengsu54楼
2011-03-18 21:23   回复  
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
媛媛12239楼
2011-03-19 15:49   回复  
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
wg42314楼
2011-03-21 23:06   回复  
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
emmanuel022718楼
2011-03-22 09:39   回复  
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
相关版块跳转 我要订阅楼主 雪人也怕冷 的主题更新
361/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +7 angus9576 2026-08-25 7/350 2026-08-25 15:50 by Weed114114
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 22/1100 2026-08-25 15:36 by 医学老男孩
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +8 yuleib84 2026-08-25 9/450 2026-08-25 15:23 by Weed114114
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 +4 ziyangfang 2026-08-25 6/300 2026-08-25 15:07 by huagongfeihu
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 18/900 2026-08-25 14:50 by Weed114114
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +5 process2012 2026-08-23 7/350 2026-08-25 09:42 by huixian257
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +17 kkkl_v 2026-08-19 18/900 2026-08-25 09:41 by windflowerwy
[基金申请] 我面上完蛋了 +13 且听虎啸 2026-08-20 14/700 2026-08-25 09:10 by mrkang
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +25 yaoyewhu2008 2026-08-20 27/1350 2026-08-25 08:01 by Equinoxhua
[基金申请] 明天应该可查了！？ +5 chengyan1220 2026-08-23 5/250 2026-08-24 23:28 by 我4大白菜
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤？
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 科研孤儿太难了 +18 我4大白菜 2026-08-20 19/950 2026-08-24 09:47 by 凯恩广盛催化分�
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭