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铜虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】western blot

求助：转膜后，丽春红染色条带很明显，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST洗三次，二抗（TBST稀释0.5--1000），涂AB液，显色后为白板，什么条带都没有。是哪里出了问题？是不是没有曝光就说明显影定影液没问题？AB液刚买的新的，也应该没问题，高手帮分析分析啊，谢谢啦'

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1楼 2011-03-18 16:15:26

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最好不要5%milk过夜，一定要那样的话也必须是新配的milk在冷室过夜。奶粉一旦变质就很难洗掉并且会极大地破坏一抗的识别能力。另外做western是要加loading control的，比如ACTIN或者GAPDH之类的，如果这些蛋白的条带都有的话就不是western技术和显影的问题。你不带loading control的话即使出来带也不能证明什么的。
立春红染色原则上是可以在block之前做的，这样做的目的是为了先确认一下，但这样做的后果往往被我们怀疑，虽然我们找不到合理的解释。其实转膜失败的概率是很低的，如果不是很心疼抗体的话，完全可以不染色直接做到曝光，曝光后没有条带的话可以回头怀疑转膜效果，这个时候把曝光后的片子用清水冲一冲然后染色一样可以确认转膜效果。而这样颠倒之后就不必担心染色对抗体特异性的潜在威胁了。