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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western blot求救(已更新）
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695

木虫 (职业作家)

[交流] 【求助/交流】western blot求救(已更新） 已有6人参与

各位好，最近在做原核表达，原核表达的是含GST的融合目的蛋白（98kD）,湿转1个小时，TBST+5%Milk封闭1-2个小时，1抗GST（sigma）在TBST+0.5%milk4度摇床过夜，然后清洗三次，2抗在室温TBST+0.5%milk1.5-2个多小时，然后TBST 洗脱3次，用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate显色，结果显出来的带跟我胶上的条带几乎完全一致，这可能是什么原因呢？抗体都是1：2500稀释的。多谢各位指点，第一次接触，谢谢了




[ Last edited by 695 on 2010-4-24 at 05:19 ]
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1楼 2010-04-21 00:07:53
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-04-21 11:25
结果显出来的带跟我胶上的条带几乎完全一致？

是什么意思？
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2楼2010-04-21 08:48:50
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1): 2010-04-21 11:25
他意思是没有特异性的蛋白全跑上面去了，而且还带了标签的。我觉得膜有问题
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3楼2010-04-21 10:40:52
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
scelab(金币+2):warm-hearted 2010-04-22 11:18
是不是说，胶先用丽春红染了一下，发现很多带，然后电转，曝光后发现膜上的带跟胶上染色的效果是一样的

严重怀疑没封闭好，换个封闭液试试
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4楼2010-04-21 13:53:39
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我觉得也是，可能是封闭这一步有问题，不知道是什么封闭液
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5楼2010-04-22 09:03:49
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liyong1981

金虫 (正式写手)
牛奶？BSA?
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6楼2010-04-22 09:04:15
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-04-21 08:48:50:
结果显出来的带跟我胶上的条带几乎完全一致？

是什么意思？

是WB的胶片上的带型和PAGE胶的带一摸一样的，今天又用NBT和BCIP相应的二抗做，结果出来的结果还是一样的，不知道该怎么解决了，一抗是sigma刚买回来的GST抗体
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7楼2010-04-22 21:30:52
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-22 09:03:49:
我觉得也是，可能是封闭这一步有问题，不知道是什么封闭液

我用的是TBST加5%non fat milk.应该不是封闭的原因吧，现在问他是胶片上不出现特异带
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8楼2010-04-22 21:31:54
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-22 09:04:15:
牛奶？BSA?

我用的是TBST milk
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9楼2010-04-22 21:32:14
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-04-21 13:53:39:
是不是说，胶先用丽春红染了一下，发现很多带，然后电转，曝光后发现膜上的带跟胶上染色的效果是一样的

严重怀疑没封闭好，换个封闭液试试

封闭不好，就是背景高点吧，不会是膜上的带与我胶上的带一样吧，我用得是TBST,5%non fat milk.
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10楼2010-04-22 21:33:41
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