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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-21 10:40:52:
他意思是没有特异性的蛋白全跑上面去了，而且还带了标签的。我觉得膜有问题

怎么会说膜有问题呢？
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11楼2010-04-22 21:34:41
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method

铜虫 (小有名气)
背景如何？
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12楼2010-04-23 16:00:57
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method

铜虫 (小有名气)
抗体可用1：20000
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13楼2010-04-23 16:06:02
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donghaiyu

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1): 2010-04-24 00:37
如果你用的一抗和二抗都是多抗，肯定会得到很多带。
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14楼2010-04-23 20:16:12
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donghaiyu

木虫 (小有名气)
建议你换抗体
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15楼2010-04-23 20:17:35
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by method at 2010-04-23 16:00:57:
背景如何？

背景没有问题的
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16楼2010-04-23 23:12:44
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
GSTtag本身就有26KDa，从你的marker来看小于26kd的也杂交上了。
肯定是你的抗体特异太低。
两个方面：
1.封闭不好，导致特异性减低。
  TBS-T需要新鲜的，你的每次都是用时才稀释TBS后再加入tween来用的吗？
   奶粉没坏？
2.抗体特异性低
   既然你说抗体新到的，确定是好的？有条件的话借别的实验室的试试。
   抗体浓度是不是高了点，商业化的抗体效率很高的。试试楼上高人的意见再稀释点。
   我杂交一抗二抗的时候通常用的TBS-T-1%milk

最后：我只想说等楼主的WB一切正常了一定记得告诉我们到底那里出了问题，让我们以后都能避免
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终于熬成木虫了……
17楼2010-04-24 05:44:15
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by zjzz at 2010-04-24 05:44:15:
GSTtag本身就有26KDa，从你的marker来看小于26kd的也杂交上了。
肯定是你的抗体特异太低。
两个方面：
1.封闭不好，导致特异性减低。
  TBS-T需要新鲜的，你的每次都是用时才稀释TBS后再加入tween来用的吗？
...

非常感谢你非常详细的讲解，我的一抗和二抗可能浓度高了点，都是1：2500左右稀释的，你一般常稀释多少倍数呢？这个图片就是用新鲜配制的TBST，抗体特异性低是可能的，因为一抗我选用的是兔源的，多抗。

[ Last edited by 695 on 2010-4-24 at 06:32 ]
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18楼2010-04-24 06:28:23
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by method at 2010-04-23 16:06:02:
抗体可用1：20000

您能给出点具体解释吗？一抗二抗都用这么高的稀释倍数？
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19楼2010-04-24 06:30:54
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
自己打兔子免疫得的抗体得看效价稀释
买的一般1：10000了
另外你可以尝试封闭过夜，一抗杂交1~2h。我一般都选择封闭过夜，最长封闭过20h
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终于熬成木虫了……
20楼2010-04-24 08:21:18
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