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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-21 10:40:52:
他意思是没有特异性的蛋白全跑上面去了,而且还带了标签的。我觉得膜有问题

怎么会说膜有问题呢?
11楼2010-04-22 21:34:41
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method

铜虫 (小有名气)

背景如何?
12楼2010-04-23 16:00:57
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method

铜虫 (小有名气)

抗体可用1:20000
13楼2010-04-23 16:06:02
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donghaiyu

木虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
scelab(金币+1): 2010-04-24 00:37
如果你用的一抗和二抗都是多抗,肯定会得到很多带。
14楼2010-04-23 20:16:12
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donghaiyu

木虫 (小有名气)

建议你换抗体
15楼2010-04-23 20:17:35
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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by method at 2010-04-23 16:00:57:
背景如何?

背景没有问题的
16楼2010-04-23 23:12:44
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
GSTtag本身就有26KDa,从你的marker来看小于26kd的也杂交上了。
肯定是你的抗体特异太低。
两个方面:
1.封闭不好,导致特异性减低。
  TBS-T需要新鲜的,你的每次都是用时才稀释TBS后再加入tween来用的吗?
   奶粉没坏?
2.抗体特异性低
   既然你说抗体新到的,确定是好的?有条件的话借别的实验室的试试。
   抗体浓度是不是高了点,商业化的抗体效率很高的。试试楼上高人的意见再稀释点。
   我杂交一抗二抗的时候通常用的TBS-T-1%milk

最后:我只想说等楼主的WB一切正常了一定记得告诉我们到底那里出了问题,让我们以后都能避免
终于熬成木虫了……
17楼2010-04-24 05:44:15
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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by zjzz at 2010-04-24 05:44:15:
GSTtag本身就有26KDa,从你的marker来看小于26kd的也杂交上了。
肯定是你的抗体特异太低。
两个方面:
1.封闭不好,导致特异性减低。
  TBS-T需要新鲜的,你的每次都是用时才稀释TBS后再加入tween来用的吗?
...

非常感谢你非常详细的讲解,我的一抗和二抗可能浓度高了点,都是1:2500左右稀释的,你一般常稀释多少倍数呢?这个图片就是用新鲜配制的TBST,抗体特异性低是可能的,因为一抗我选用的是兔源的,多抗。

[ Last edited by 695 on 2010-4-24 at 06:32 ]
18楼2010-04-24 06:28:23
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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by method at 2010-04-23 16:06:02:
抗体可用1:20000

您能给出点具体解释吗?一抗二抗都用这么高的稀释倍数?
19楼2010-04-24 06:30:54
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
自己打兔子免疫得的抗体得看效价稀释
买的一般1:10000了
另外你可以尝试封闭过夜,一抗杂交1~2h。我一般都选择封闭过夜,最长封闭过20h
终于熬成木虫了……
20楼2010-04-24 08:21:18
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