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695

木虫 (职业作家)

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[交流] 【求助/交流】western blot求救(已更新）已有6人参与

各位好，最近在做原核表达，原核表达的是含GST的融合目的蛋白（98kD）,湿转1个小时，TBST+5%Milk封闭1-2个小时，1抗GST（sigma）在TBST+0.5%milk4度摇床过夜，然后清洗三次，2抗在室温TBST+0.5%milk1.5-2个多小时，然后TBST 洗脱3次，用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate显色，结果显出来的带跟我胶上的条带几乎完全一致，这可能是什么原因呢？抗体都是1：2500稀释的。多谢各位指点，第一次接触，谢谢了

[ Last edited by 695 on 2010-4-24 at 05:19 ]

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1楼 2010-04-21 00:07:53

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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上

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★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

GSTtag本身就有26KDa，从你的marker来看小于26kd的也杂交上了。
肯定是你的抗体特异太低。
两个方面：
1.封闭不好，导致特异性减低。
TBS-T需要新鲜的，你的每次都是用时才稀释TBS后再加入tween来用的吗？
奶粉没坏？
2.抗体特异性低
既然你说抗体新到的，确定是好的？有条件的话借别的实验室的试试。
抗体浓度是不是高了点，商业化的抗体效率很高的。试试楼上高人的意见再稀释点。
我杂交一抗二抗的时候通常用的TBS-T-1%milk

最后：我只想说等楼主的WB一切正常了一定记得告诉我们到底那里出了问题，让我们以后都能避免