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695

木虫 (职业作家)

[交流] 【求助/交流】western blot求救(已更新) 已有6人参与

各位好,最近在做原核表达,原核表达的是含GST的融合目的蛋白(98kD),湿转1个小时,TBST+5%Milk封闭1-2个小时,1抗GST(sigma)在TBST+0.5%milk4度摇床过夜,然后清洗三次,2抗在室温TBST+0.5%milk1.5-2个多小时,然后TBST 洗脱3次,用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate显色,结果显出来的带跟我胶上的条带几乎完全一致,这可能是什么原因呢?抗体都是1:2500稀释的。多谢各位指点,第一次接触,谢谢了




[ Last edited by 695 on 2010-4-24 at 05:19 ]
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-04-21 11:25
结果显出来的带跟我胶上的条带几乎完全一致?

是什么意思?
2楼2010-04-21 08:48:50
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liyong1981

金虫 (正式写手)


★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1): 2010-04-21 11:25
他意思是没有特异性的蛋白全跑上面去了,而且还带了标签的。我觉得膜有问题
3楼2010-04-21 10:40:52
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
scelab(金币+2):warm-hearted 2010-04-22 11:18
是不是说,胶先用丽春红染了一下,发现很多带,然后电转,曝光后发现膜上的带跟胶上染色的效果是一样的

严重怀疑没封闭好,换个封闭液试试
4楼2010-04-21 13:53:39
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liyong1981

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我觉得也是,可能是封闭这一步有问题,不知道是什么封闭液
5楼2010-04-22 09:03:49
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liyong1981

金虫 (正式写手)


牛奶?BSA?
6楼2010-04-22 09:04:15
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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-04-21 08:48:50:
结果显出来的带跟我胶上的条带几乎完全一致?

是什么意思?

是WB的胶片上的带型和PAGE胶的带一摸一样的,今天又用NBT和BCIP相应的二抗做,结果出来的结果还是一样的,不知道该怎么解决了,一抗是sigma刚买回来的GST抗体
7楼2010-04-22 21:30:52
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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-22 09:03:49:
我觉得也是,可能是封闭这一步有问题,不知道是什么封闭液

我用的是TBST加5%non fat milk.应该不是封闭的原因吧,现在问他是胶片上不出现特异带
8楼2010-04-22 21:31:54
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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-22 09:04:15:
牛奶?BSA?

我用的是TBST milk
9楼2010-04-22 21:32:14
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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-04-21 13:53:39:
是不是说,胶先用丽春红染了一下,发现很多带,然后电转,曝光后发现膜上的带跟胶上染色的效果是一样的

严重怀疑没封闭好,换个封闭液试试

封闭不好,就是背景高点吧,不会是膜上的带与我胶上的带一样吧,我用得是TBST,5%non fat milk.
10楼2010-04-22 21:33:41
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