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雪人也怕冷

铜虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】western blot

求助：转膜后，丽春红染色条带很明显，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST洗三次，二抗（TBST稀释0.5--1000），涂AB液，显色后为白板，什么条带都没有。是哪里出了问题？是不是没有曝光就说明显影定影液没问题？AB液刚买的新的，也应该没问题，高手帮分析分析啊，谢谢啦'

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1楼 2011-03-18 16:15:26

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314300420

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引用回帖:

Originally posted by 雪人也怕冷 at 2011-03-18 16:15:26:
求助：转膜后，丽春红染色条带很明显，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST洗三次，二抗（TBST稀释0.5--1000），涂AB液，显色后为白板，什么条带都没有。是哪里出了问题？是不是没有曝光就说 ...

楼主做的是纯化后的蛋白WB检测还是从细胞提取的总蛋白？要是纯化后的蛋白，立春红染色能看见明显的条带，再用WB检测，这个上样量就太大了，0.1~0.5ug就足够了，最后曝光为白板，我分析认为是上样量太大，结合的一抗、二抗过多，最后加显色液时大量的二抗迅速将底物消耗掉，等你曝光时因底物已消耗完了，荧光消失，所以才会白板，若使用的显色液为ECL这样的发光液，不妨再加完ECL之后将灯关掉，在黑暗的环境中观察是否有荧光，若是有而且很亮，基本上就是我说的这种情况了，或者显影液不行了，要是没有荧光可以考虑一抗是否可以识别你的抗原的问题了。