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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western blot
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雪人也怕冷

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】western blot

求助：转膜后，丽春红染色条带很明显，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST洗三次，二抗（TBST稀释0.5--1000），涂AB液，显色后为白板，什么条带都没有。是哪里出了问题？是不是没有曝光就说明显影定影液没问题？AB液刚买的新的，也应该没问题，高手帮分析分析啊，谢谢啦'
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1楼 2011-03-18 16:15:26
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chenyyy

无虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
转膜时间久了？
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2楼2011-03-18 17:14:10
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hwlightning

铜虫 (初入文坛)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
丽春红染色害人
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3楼2011-03-18 17:54:59
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冬虫夏草1

金虫 (小有名气)
★ ★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:39:08
雪人也怕冷(金币+1): 2011-03-22 11:13:37
你是不应该有两块胶，一块儿用于染色观察条带是否明显且有无特异带。第二块儿用于转膜杂交，确定杂交信号。
现在是你的杂交结果没信号，若排除显色问题，就是你的跑胶或转膜出了披露。
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5楼2011-03-18 22:09:44
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1992xlliu

金虫 (小有名气)
★ ★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:39:18
估计洗丽春红的过程中蛋白被洗掉了。
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6楼2011-03-18 22:44:52
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libin051mail

铜虫 (初入文坛)
★ ★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-19 09:39:14
雪人也怕冷(金币+1): 2011-03-22 11:13:55
首先考虑一抗是否合理
其次二抗是否抗一抗
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7楼2011-03-18 23:17:09
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jjwl_rscn

金虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
走过路过不要错过
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8楼2011-03-19 15:10:18
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shenlang007

木虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
雪人也怕冷(金币+1): 2011-03-22 11:14:03
蛋白浓度如何？actin呢
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10楼2011-03-19 16:56:25
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
做实验一定要做阳性对照，向别人要曾经做出来的蛋白来确定是不是操作问题；再试试一抗37度1.5—2h；混合二抗和AB液，暗室看是否有荧光
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11楼2011-03-21 20:46:55
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paulpaulzj

至尊木虫 (知名作家)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
转膜过了好像可以排除。
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12楼2011-03-21 20:51:56
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ls2046

铁杆木虫 (职业作家)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
纯学习，，，
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13楼2011-03-21 22:56:31
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
雪人也怕冷(金币+2): 谢谢 2011-03-22 11:16:24
1.转膜后直接封闭，不要染什么色了。
2.1抗2抗封闭蛋白面要向下（无论你用什么方法），还不能漏出一抗二抗。
3.1抗要4°过夜效果更好。
4.内参出条带了吗？内参要是出了。就是你1抗问题，浓度低了。来个1:200试试吧。
5.做wb要看运气的。
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15楼2011-03-21 23:19:15
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
帮顶。。。。。。
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16楼2011-03-22 09:20:31
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meiying3061

木虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
建议做个不染色的胶的对照，曝一下内参看看
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17楼2011-03-22 09:27:14
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雪人也怕冷

铜虫 (初入文坛)

谢谢各位帮忙

我已经找到问题，并解决掉啦，一抗用的太少，造成虹吸现象，没有孵上
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19楼2011-03-22 11:15:45
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
一步一步排除吧
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20楼2011-03-22 12:20:38
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believemin

金虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
恩  有可能是洗去丽春红染液时把蛋白洗没了，要不就是一抗二抗的浓度再调一下，，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST？这么说你弄了三天？其实封闭不用那么长时间的，37度一到两小时就可以了
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21楼2011-03-22 16:10:56
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lavender169

木虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
你这个信息太少 转膜用的哪种方法 多久？ 你5%的奶粉封闭也过夜？  你显色多久？AB夜是普通的还是加强型的？
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22楼2011-03-29 13:49:24
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lavender169

木虫 (正式写手)
你这个信息太少 转膜用的哪种方法 多久？ 你5%的奶粉封闭也过夜？  你显色多久？AB夜是普通的还是加强型的？
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23楼2011-03-29 13:53:22
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terry130

木虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
最好不要5%milk过夜，一定要那样的话也必须是新配的milk在冷室过夜。奶粉一旦变质就很难洗掉并且会极大地破坏一抗的识别能力。另外做western是要加loading control的，比如ACTIN或者GAPDH之类的，如果这些蛋白的条带都有的话就不是western技术和显影的问题。你不带loading control的话即使出来带也不能证明什么的。
立春红染色原则上是可以在block之前做的，这样做的目的是为了先确认一下，但这样做的后果往往被我们怀疑，虽然我们找不到合理的解释。其实转膜失败的概率是很低的，如果不是很心疼抗体的话，完全可以不染色直接做到曝光，曝光后没有条带的话可以回头怀疑转膜效果，这个时候把曝光后的片子用清水冲一冲然后染色一样可以确认转膜效果。而这样颠倒之后就不必担心染色对抗体特异性的潜在威胁了。
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24楼2011-03-29 15:20:16
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zjdzhang

禁虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
本帖内容被屏蔽
25楼2011-04-06 12:21:39
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 雪人也怕冷 at 2011-03-18 16:15:26:
求助：转膜后，丽春红染色条带很明显，5%脱脂奶粉过夜，一抗（TBST稀释2-1000）孵育4°过夜，TBST洗三次，二抗（TBST稀释0.5--1000），涂AB液，显色后为白板，什么条带都没有。是哪里出了问题？是不是没有曝光就说 ...

楼主做的是纯化后的蛋白WB检测还是从细胞提取的总蛋白？要是纯化后的蛋白，立春红染色能看见明显的条带，再用WB检测，这个上样量就太大了，0.1~0.5ug就足够了，最后曝光为白板，我分析认为是上样量太大，结合的一抗、二抗过多，最后加显色液时大量的二抗迅速将底物消耗掉，等你曝光时因底物已消耗完了，荧光消失，所以才会白板，若使用的显色液为ECL这样的发光液，不妨再加完ECL之后将灯关掉，在黑暗的环境中观察是否有荧光，若是有而且很亮，基本上就是我说的这种情况了，或者显影液不行了，要是没有荧光可以考虑一抗是否可以识别你的抗原的问题了。
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26楼2011-04-12 15:55:58
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fjj5d20

金虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
你跑的是什么蛋白  容易出不容易 如果容易出的 没出来 则要找找western系统的原因了 但是 如果蛋白本来表达量就很低 不容易出 那就改变条件再跑
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27楼2011-04-17 16:19:31
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Mingn1

金虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
看别人做，自己没做过，帮不上忙
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28楼2011-04-17 16:30:41
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luohuacheng

新虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
一般就是一抗二抗的问题。另外，封闭不需要过夜吧。如果实在不行，可以先检测二抗是否可行。就是看二抗和AB液反应，是否存在荧光。
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29楼2011-04-27 21:59:59
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
帮顶
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30楼2011-04-28 12:43:31
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
我觉得一抗和二抗出了问题
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31楼2011-04-28 13:11:28
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juanjuan11

金虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
你的抗体效价怎么样啊？ 若一般，可能是一抗二抗浓度太小了
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32楼2011-04-28 15:29:58
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河外生命

木虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
l丽春红染色是不会有问题的。我们实验室每次都是要用丽春红染色确认一下蛋白是否转上。之后用TBST洗一下就可以。
感觉你的情况跟我们实验室有段时间的情况很相似，就是发光时可以很明显的看到膜上的荧光，就是曝光后，胶片上什么都没有，是张白片。当时我们就觉得显影液有问题，后来换了新的显影液，果然没再出现那种状况。试下更换新的显影液吧。
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33楼2011-04-28 15:35:07
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zhaotao1985

新虫 (初入文坛)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
??
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34楼2011-04-30 23:12:04
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leilaye

铜虫 (小有名气)
★
雪人也怕冷(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
15楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2011-03-21 23:19:15:
1.转膜后直接封闭，不要染什么色了。
2.1抗2抗封闭蛋白面要向下（无论你用什么方法），还不能漏出一抗二抗。
3.1抗要4°过夜效果更好。
4.内参出条带了吗？内参要是出了。就是你1抗问题，浓度低了。来个1:200试 ...

对于2，蛋白面向下会不会摇床摇得把蛋白磨掉了，我之前都是向上 可以做出来。。。。。。。。。。。。不过最近没有条带，运气衰死了。。
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35楼2012-02-16 11:03:15
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
雪人也怕冷(金币+1): 谢谢参与
我的目前也是这个情况，求高手指点
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36楼2012-07-09 12:16:23
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weishengsu54楼
2011-03-18 21:23   回复  
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媛媛12239楼
2011-03-19 15:49   回复  
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wg42314楼
2011-03-21 23:06   回复  
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emmanuel022718楼
2011-03-22 09:39   回复  
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