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yananjizhu

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[交流] 【求助/交流】westernblot已有5人参与

各位虫友：
大家好，想问下做westernblot时上样量一样，为什么最后显色时条带的宽窄和明暗不一样呢，是抗体假的不均匀，还是转膜时转到膜上的量就不一样，或者还有其他的原因，谢谢指教

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1楼2011-04-09 17:58:29

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yananjizhu

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引用回帖:

Originally posted by ujsyangyong at 2011-04-10 11:33:10:
这要看你每个泳道所上蛋白样品中目的蛋白的表达量是否存在差异，如果确实存在差异，那么出现这种结果就是完全正常的。不过需要排除由于上样、转膜、孵育抗体以及显色不均匀带来的影响。我Wersternblot做过很多，总 ...

谢谢我的分子量是180 你有没遇到过这么大分子量的我的转膜时间是3.5h，会不会有点过长条带跑出来也不很均匀改怎么修正请指教谢谢您

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7楼2011-04-11 17:49:15

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ujsyangyong

铁杆木虫 (著名写手)

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西瓜(金币+5): 鼓励交流。很细致很专业。 2011-04-10 11:45:52
西瓜(EPI+1): 鼓励！ 2011-04-10 14:55:29

这要看你每个泳道所上蛋白样品中目的蛋白的表达量是否存在差异，如果确实存在差异，那么出现这种结果就是完全正常的。不过需要排除由于上样、转膜、孵育抗体以及显色不均匀带来的影响。我Wersternblot做过很多，总结了一些经验，将上述步骤中可能产生偏差的解决方法总结如下：
上样：上样前先测定蛋白浓度，根据每泳道上样蛋白总量相等的原则计算上样体积，最好先染内参验证一下是否每泳道一致。
转膜：确保胶与膜之间平整接触，不要留有气泡，滤纸要平整光滑，在胶上盖膜的时候，将膜用转膜缓冲液浸湿，采用平推的方式可以避免气泡产生。
孵育抗体：膜不要太大，能覆盖目的条带的最小面积就可以了，孵育抗体的时候最好是将膜完整的泡在抗体稀释液中（比较烧钱，国内一般都不会这么做），我们是用封口膜绷在96孔板上，然后将抗体加在封口膜上，依靠液体的表面张力，会形成露珠状，然后将封闭后的膜用滤纸吸干（一定要吸干），将蛋白面反扣在抗体稀释液上，避免抗体跑到膜的背面，这样整张膜就完全漂浮在抗体上，如果抗体跑到膜的反面，则膜可能由于重量沉下去，与封口膜紧贴，紧贴部分抗体孵育就不足，当然就会产生条带染色较浅的现象了。
加发光剂：方法同加抗体，也可以蛋白面朝上，将发光剂滴加在膜表面，对着光看一下是不是整张膜都被发光剂覆盖了。
其中抗体孵育缓解是最容易对结果产生影响的，主要注意以下三点：
1.在允许的情况下尽量减少膜的面积，减轻膜的自重和抗体用量
2.还有上抗体前将膜吸干可以避免抗体跑到膜的背面
3.抗体量不能太少，一般25平方厘米的膜抗体稀释液用量在1.5ml左右

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