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Fire0304银虫 (小有名气)
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western blot 求助，请高手指点一下
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初次做western blot，蛋白分子量是57kD， 第一次试验：浓缩胶4% 80V，分离胶10%，100V， PVDF膜转膜300mA 60min，丽春红染色无条带，封闭2h，一抗1:300，内参抗体1:500,4°C过夜，二抗1:2000,室温1h 结果：目的蛋白6条带均出现，但不清晰，内参条带未见，多次压片结果同上。 第二次试验：浓缩胶4%，40V，分离胶10%，85V，PVDF膜转膜250mA 80min，用上次及新配的一抗、内参抗体、二抗，余条件不变。 结果：目的蛋白条带均未见。内参条带出现，但不清晰。多次压片结果同上。用考马斯亮蓝染胶未见蛋白条带。 第三次实验：浓缩胶4%，30V，分离胶10%，60V，其余均与第二次实验条件相同，结果什么都没有看到，过后考马斯亮蓝染胶、染膜均可见清晰蛋白条带，但条带聚集较紧凑。 分析：第一次实验有结果，但内参未见，第二次实验无结果，但可见内参一，用的是新旧一抗，内参抗体及二抗，第三次实验无结果，抗体同前，考虑一抗出现问题。 考马斯亮蓝染胶、染膜均可见清晰蛋白条带，但条带聚集较紧凑，考虑胶浓度过大。 请各位高手指点一下，让小弟可顺利完成实验。。。。谢谢 |
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