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【求助/交流】请教Western blot出现非特异性条带的怎么解决
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| 大家好，我的蛋白是30KD，我做Western blot封闭用的是30%的BSA，时间是4度过夜，我用的一抗是兔抗组氨酸标签抗体，37度孵育2h，二抗是羊抗兔的37度孵育2h，但是结果总出现非特异性条带，请高手帮帮忙！ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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ben1147
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linysm
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WB出现非特异性条带的原因与解决方法： 1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度。 2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体。 3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。 4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量。 5.样品蛋白质发生了降解，降解产物成为了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是单克隆抗体时更为明显；避免对样品蛋白质反复冻融，食用新鲜的蛋白质样品，可以使用蛋白酶的广谱抑制剂（已经有商用产品），必要的话使用分子筛层析或HPLC纯化蛋白质样品后再上样（HPLC不能用于蛋白质制备，不过用做WB的量还是能够提供的）。 6.细胞传代过多，导致蛋白质变异。使用传代次数少的细胞的表达的蛋白质进行对比，并且作为分子筛层析或HPLC的纯化标准。 |
9楼2014-07-12 00:23:01
