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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？
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wazlf

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？

我做的是线粒体16s ，长度大约为600bp，但是PCR后没有目的条带，只有230bp左右的条带，附有图片，请哪位高手指导一下，非常感谢！
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1楼2011-02-27 13:47:57
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
wazlf(金币+1): 2011-02-27 15:28:55
dhd997(金币+2): 对了 2011-02-28 10:46:11
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 13:47:57:
我做的是线粒体16s ，长度大约为600bp，但是PCR后没有目的条带，只有230bp左右的条带，附有图片，请哪位高手指导一下，非常感谢！

兄弟，以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1
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2楼2011-02-27 13:49:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-02-27 14:07:04
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 13:47:57:
我做的是线粒体16s ，长度大约为600bp，但是PCR后没有目的条带，只有230bp左右的条带，附有图片，请哪位高手指导一下，非常感谢！

你指的230bp左右的条带是最左边的那个么？

觉得特异性好差啊，用的是通用引物还是你自己设计的呢？

PCR反应体系，条件也列一下吧。

中间那么多亮带是不是引物二聚体呢？
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3楼2011-02-27 13:56:17
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
，不好意思，楼主貌似是位MM，这个头像。。。。。。火影看多了。。
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4楼2011-02-27 14:04:15
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wazlf

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-27 13:49:42:
兄弟，以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1

呵呵，没关系啦！我也喜欢火影。是在文献上看见的，有人做过，只是为后来的长PCR做引物设计用。
PCR条件：
预变性94℃，3min——变性94℃45s——51℃退火1min——72℃延伸1min，共运行35个循环，最后延伸10分钟。最左边的那个不是，是师兄让我帮他顺便看看maker怎么样。
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5楼2011-02-27 15:39:16
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wazlf

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-27 13:49:42:
兄弟，以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1

反应体系是50μL：mix25μL，水23μL，引物各0.5μL，模板1μL.那个是非特异性条带。怎样做改进，才能的到想要的条带？还有这事哪些方面的问题？
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6楼2011-02-27 15:44:31
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:32:41
wazlf(金币+5): 谢谢你了！ 2011-02-28 13:09:42
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 15:44:31:
反应体系是50μL：mix25μL，水23μL，引物各0.5μL，模板1μL.那个是非特异性条带。怎样做改进，才能的到想要的条带？还有这事哪些方面的问题？

呵呵，非特异的好一致呀，我还以为是引物二聚体呢。

你做真核线粒体的16S，这个我没有做过，不知道在不同物种之间的保守性有没

有细菌那么高。你引物来源的那篇文献和你做的是一个物种的么？

如果那个是非特异性扩增，那么亮的话，说明你的引物还是没有设计好，我看你

的退火温度才51度，可以再延长引物以提高退火温度。这个我觉得是最快速的方

法了。

另外不知道你设计的引物的理论Tm是多少，可不可以在51度的基础上再拉高几

度呢？比如到55、58的样子。


还有就是可以做一个touchdown PCR看看结果会不会有改善。

上面这两个可以先做，没提高的话就别优化什么了，重新设计引物。
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7楼2011-02-27 15:55:16
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★ ★
wazlf(金币+3): 2011-03-01 20:21:34
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-06 15:06:07
那个我测过，不过是1.3KB左右的长度。
同意7楼的。。。我再帮忙整理下：
（遇到这种情况一般先调整温度，再调整体系，再重新设计引物）
1、可以先用梯度PCR做不同退火温度。51确实低。可以每提高3度，一起做。
2、可以用TOUCHDOWN,理由是提高特异性
或者TOUCHUP，理由是你的模板质量差
3、增加模板用量，再另外加些MG2+，有条件的话可以加一些Q BUFFER或DMSO。。不过你才扩600多的，估计用不着，但是可以试试DMSO，便宜。
4、重新设计或合成引物
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8楼2011-03-01 11:38:19
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花瓣雨_ice

木虫 (小有名气)
wazlf(金币+1): 2011-03-08 15:29:23
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 15:44:31:
反应体系是50μL：mix25μL，水23μL，引物各0.5μL，模板1μL.那个是非特异性条带。怎样做改进，才能的到想要的条带？还有这事哪些方面的问题？

我感觉你的反应体系适当改变下，我做 PCR 20ul的反应体系都放1ul的引物的，是不是你的引物量少的缘故啊。
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9楼2011-03-06 10:13:42
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lisa68320

新虫 (初入文坛)
★
lstt09nk(金币+1): 有道理~~欢迎常来生物板交流 2011-03-06 15:07:33
wazlf(金币+1): 谢谢啊！呵呵……这是个好方法，我会参考的！ 2011-03-08 15:31:59
个人经验，通过优化PCR条件最终或许可以得到目的条带，但是要花很多的时间，如果实验很急道不如重新设计引物，也许一次就PCR成功了，我们lab基本不把精力放在优化上，太花时间了。

仅供参考
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10楼2011-03-06 12:34:15
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wazlf

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 花瓣雨_ice at 2011-03-06 10:13:42:
我感觉你的反应体系适当改变下，我做 PCR 20ul的反应体系都放1ul的引物的，是不是你的引物量少的缘故啊。

引物少的话，就不会出现引物二聚体了
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11楼2011-03-08 15:30:11
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花瓣雨_ice

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-03-08 15:30:11:
引物少的话，就不会出现引物二聚体了

可是 我觉得你的电泳条带 最下面的就像是引物二聚体啊
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12楼2011-03-09 11:39:54
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hulqi

金虫 (正式写手)
wazlf(金币+2): 嗯额，谢谢交流！ 2011-03-19 22:18:44
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 15:39:16:
呵呵，没关系啦！我也喜欢火影。是在文献上看见的，有人做过，只是为后来的长PCR做引物设计用。
PCR条件：
预变性94℃，3min——变性94℃45s——51℃退火1min——72℃延伸1min，共运行35个循环，最后延伸10分 ...

你那个就是引物二聚体，没P出来，重新设计引物吧，或者做个T度PCR
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13楼2011-03-09 13:32:18
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wazlf

银虫 (正式写手)
我的问题解决了，谢谢大家啊！
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14楼2011-03-16 22:48:29
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187321874

木虫 (知名作家)
wazlf(金币+1): 2011-03-19 22:18:16
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-03-16 22:48:29:
我的问题解决了，谢谢大家啊！

呵呵，楼主好认真呢，看看站内信吧
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15楼2011-03-19 10:25:39
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
wazlf(金币+1): 是引物的问题 2011-03-19 22:18:01
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-03-26 08:47:44
没做阳性对照？反应无法知道体系是否有问题啊。。

看引物二聚体比较明显，可能是引物的问题。。
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16楼2011-03-19 10:43:23
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-03-26 08:48:09
要多放点模板，我觉得你提的DNA中核基因组比较多，看看怎么优化能将线粒体DNA提取出来.
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17楼2011-03-24 11:03:05
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chen4

新虫 (初入文坛)

楼主你好

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-03-16 22:48:29:
我的问题解决了，谢谢大家啊！

你那个就是引物二聚体，和我P出来结果一样啊，你的问题解决了，可以告诉一下小弟方法吗？在这方面小弟是个菜鸟。
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18楼2011-03-26 08:20:19
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wazlf

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by chen4 at 2011-03-26 08:20:19:
你那个就是引物二聚体，和我P出来结果一样啊，你的问题解决了，可以告诉一下小弟方法吗？在这方面小弟是个菜鸟。

我就是做了个touchdown，确定了退火的最适温度，改变了一下模板的浓度，就好了！哦，还有，我的引物设计的不好，就重新设计了一对引物！希望对你有所帮助……
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19楼2011-03-26 23:27:32
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
说到底，还是引物的问题，引物不对，都没用到目的带上，自己配对了，当然出现这么多二聚体咯
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20楼2012-08-18 20:28:21
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海之子211

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by wazlf at 2011-03-16 22:48:29
我的问题解决了，谢谢大家啊！

楼主怎么解决的
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21楼2013-09-11 09:35:43
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