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【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？
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我做的是线粒体16s ，长度大约为600bp，但是PCR后没有目的条带，只有230bp左右的条带，附有图片，请哪位高手指导一下，非常感谢！ |
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 核酸生物学实验经验 |
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wazlf(金币+1): 2011-02-27 15:28:55
dhd997(金币+2): 对了 2011-02-28 10:46:11
wazlf(金币+1): 2011-02-27 15:28:55
dhd997(金币+2): 对了 2011-02-28 10:46:11
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兄弟，以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1 |
2楼2011-02-27 13:49:42
brightfuture01
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3楼2011-02-27 13:56:17
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，不好意思，楼主貌似是位MM，这个头像。。。。。。火影看多了。。4楼2011-02-27 14:04:15
5楼2011-02-27 15:39:16
6楼2011-02-27 15:44:31
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rainwander(金币+5): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:32:41
wazlf(金币+5): 谢谢你了！ 2011-02-28 13:09:42
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wazlf(金币+5): 谢谢你了！ 2011-02-28 13:09:42
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呵呵，非特异的好一致呀，我还以为是引物二聚体呢。 你做真核线粒体的16S，这个我没有做过，不知道在不同物种之间的保守性有没 有细菌那么高。你引物来源的那篇文献和你做的是一个物种的么？ 如果那个是非特异性扩增，那么亮的话，说明你的引物还是没有设计好，我看你 的退火温度才51度，可以再延长引物以提高退火温度。这个我觉得是最快速的方 法了。 另外不知道你设计的引物的理论Tm是多少，可不可以在51度的基础上再拉高几 度呢？比如到55、58的样子。 还有就是可以做一个touchdown PCR看看结果会不会有改善。 上面这两个可以先做，没提高的话就别优化什么了，重新设计引物。 |
7楼2011-02-27 15:55:16
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wazlf(金币+3): 2011-03-01 20:21:34
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-06 15:06:07
wazlf(金币+3): 2011-03-01 20:21:34
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-06 15:06:07
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那个我测过，不过是1.3KB左右的长度。 同意7楼的。。。我再帮忙整理下： （遇到这种情况一般先调整温度，再调整体系，再重新设计引物） 1、可以先用梯度PCR做不同退火温度。51确实低。可以每提高3度，一起做。 2、可以用TOUCHDOWN,理由是提高特异性 或者TOUCHUP，理由是你的模板质量差 3、增加模板用量，再另外加些MG2+，有条件的话可以加一些Q BUFFER或DMSO。。不过你才扩600多的，估计用不着，但是可以试试DMSO，便宜。 4、重新设计或合成引物 |
8楼2011-03-01 11:38:19
9楼2011-03-06 10:13:42
10楼2011-03-06 12:34:15
11楼2011-03-08 15:30:11
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