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wazlf

银虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】PCR后没有目的条带,有非特异性条带,求解决办法??

我做的是线粒体16s ,长度大约为600bp,但是PCR后没有目的条带,只有230bp左右的条带,附有图片,请哪位高手指导一下,非常感谢!
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★ ★
wazlf(金币+1): 2011-02-27 15:28:55
dhd997(金币+2): 对了 2011-02-28 10:46:11
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 13:47:57:
我做的是线粒体16s ,长度大约为600bp,但是PCR后没有目的条带,只有230bp左右的条带,附有图片,请哪位高手指导一下,非常感谢!

兄弟,以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1
2楼2011-02-27 13:49:42
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★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-02-27 14:07:04
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 13:47:57:
我做的是线粒体16s ,长度大约为600bp,但是PCR后没有目的条带,只有230bp左右的条带,附有图片,请哪位高手指导一下,非常感谢!

你指的230bp左右的条带是最左边的那个么?

觉得特异性好差啊,用的是通用引物还是你自己设计的呢?

PCR反应体系,条件也列一下吧。

中间那么多亮带是不是引物二聚体呢?
3楼2011-02-27 13:56:17
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,不好意思,楼主貌似是位MM,这个头像。。。。。。火影看多了。。
4楼2011-02-27 14:04:15
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wazlf

银虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-27 13:49:42:
兄弟,以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1

呵呵,没关系啦!我也喜欢火影。是在文献上看见的,有人做过,只是为后来的长PCR做引物设计用。
PCR条件:
预变性94℃,3min——变性94℃45s——51℃退火1min——72℃延伸1min,共运行35个循环,最后延伸10分钟。最左边的那个不是,是师兄让我帮他顺便看看maker怎么样。
5楼2011-02-27 15:39:16
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wazlf

银虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-27 13:49:42:
兄弟,以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1

反应体系是50μL:mix25μL,水23μL,引物各0.5μL,模板1μL.那个是非特异性条带。怎样做改进,才能的到想要的条带?还有这事哪些方面的问题?
6楼2011-02-27 15:44:31
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★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:32:41
wazlf(金币+5): 谢谢你了! 2011-02-28 13:09:42
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 15:44:31:
反应体系是50μL:mix25μL,水23μL,引物各0.5μL,模板1μL.那个是非特异性条带。怎样做改进,才能的到想要的条带?还有这事哪些方面的问题?

呵呵,非特异的好一致呀,我还以为是引物二聚体呢。

你做真核线粒体的16S,这个我没有做过,不知道在不同物种之间的保守性有没

有细菌那么高。你引物来源的那篇文献和你做的是一个物种的么?

如果那个是非特异性扩增,那么亮的话,说明你的引物还是没有设计好,我看你

的退火温度才51度,可以再延长引物以提高退火温度。这个我觉得是最快速的方

法了。

另外不知道你设计的引物的理论Tm是多少,可不可以在51度的基础上再拉高几

度呢?比如到55、58的样子。


还有就是可以做一个touchdown PCR看看结果会不会有改善。

上面这两个可以先做,没提高的话就别优化什么了,重新设计引物。
7楼2011-02-27 15:55:16
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spiderboy

金虫 (正式写手)


★ ★
wazlf(金币+3): 2011-03-01 20:21:34
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-03-06 15:06:07
那个我测过,不过是1.3KB左右的长度。
同意7楼的。。。我再帮忙整理下:
(遇到这种情况一般先调整温度,再调整体系,再重新设计引物)
1、可以先用梯度PCR做不同退火温度。51确实低。可以每提高3度,一起做。
2、可以用TOUCHDOWN,理由是提高特异性
或者TOUCHUP,理由是你的模板质量差
3、增加模板用量,再另外加些MG2+,有条件的话可以加一些Q BUFFER或DMSO。。不过你才扩600多的,估计用不着,但是可以试试DMSO,便宜。
4、重新设计或合成引物
8楼2011-03-01 11:38:19
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花瓣雨_ice

木虫 (小有名气)


wazlf(金币+1): 2011-03-08 15:29:23
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 15:44:31:
反应体系是50μL:mix25μL,水23μL,引物各0.5μL,模板1μL.那个是非特异性条带。怎样做改进,才能的到想要的条带?还有这事哪些方面的问题?

我感觉你的反应体系适当改变下,我做 PCR 20ul的反应体系都放1ul的引物的,是不是你的引物量少的缘故啊。
9楼2011-03-06 10:13:42
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lisa68320

新虫 (初入文坛)



lstt09nk(金币+1): 有道理~~欢迎常来生物板交流 2011-03-06 15:07:33
wazlf(金币+1): 谢谢啊!呵呵……这是个好方法,我会参考的! 2011-03-08 15:31:59
个人经验,通过优化PCR条件最终或许可以得到目的条带,但是要花很多的时间,如果实验很急道不如重新设计引物,也许一次就PCR成功了,我们lab基本不把精力放在优化上,太花时间了。

仅供参考
10楼2011-03-06 12:34:15
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wazlf

银虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by 花瓣雨_ice at 2011-03-06 10:13:42:
我感觉你的反应体系适当改变下,我做 PCR 20ul的反应体系都放1ul的引物的,是不是你的引物量少的缘故啊。

引物少的话,就不会出现引物二聚体了
11楼2011-03-08 15:30:11
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花瓣雨_ice

木虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-03-08 15:30:11:
引物少的话,就不会出现引物二聚体了

可是 我觉得你的电泳条带 最下面的就像是引物二聚体啊
12楼2011-03-09 11:39:54
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hulqi

金虫 (正式写手)


wazlf(金币+2): 嗯额,谢谢交流! 2011-03-19 22:18:44
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 15:39:16:
呵呵,没关系啦!我也喜欢火影。是在文献上看见的,有人做过,只是为后来的长PCR做引物设计用。
PCR条件:
预变性94℃,3min——变性94℃45s——51℃退火1min——72℃延伸1min,共运行35个循环,最后延伸10分 ...

你那个就是引物二聚体,没P出来,重新设计引物吧,或者做个T度PCR
13楼2011-03-09 13:32:18
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wazlf

银虫 (正式写手)


我的问题解决了,谢谢大家啊!
14楼2011-03-16 22:48:29
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187321874

木虫 (知名作家)


wazlf(金币+1): 2011-03-19 22:18:16
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-03-16 22:48:29:
我的问题解决了,谢谢大家啊!

呵呵,楼主好认真呢,看看站内信吧
15楼2011-03-19 10:25:39
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rioarsenal

金虫 (正式写手)



wazlf(金币+1): 是引物的问题 2011-03-19 22:18:01
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-03-26 08:47:44
没做阳性对照?反应无法知道体系是否有问题啊。。

看引物二聚体比较明显,可能是引物的问题。。
16楼2011-03-19 10:43:23
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)


★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-03-26 08:48:09
要多放点模板,我觉得你提的DNA中核基因组比较多,看看怎么优化能将线粒体DNA提取出来.
17楼2011-03-24 11:03:05
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chen4

新虫 (初入文坛)


楼主你好


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-03-16 22:48:29:
我的问题解决了,谢谢大家啊!

你那个就是引物二聚体,和我P出来结果一样啊,你的问题解决了,可以告诉一下小弟方法吗?在这方面小弟是个菜鸟。
18楼2011-03-26 08:20:19
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wazlf

银虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by chen4 at 2011-03-26 08:20:19:
你那个就是引物二聚体,和我P出来结果一样啊,你的问题解决了,可以告诉一下小弟方法吗?在这方面小弟是个菜鸟。

我就是做了个touchdown,确定了退火的最适温度,改变了一下模板的浓度,就好了!哦,还有,我的引物设计的不好,就重新设计了一对引物!希望对你有所帮助……
19楼2011-03-26 23:27:32
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hxswdl

至尊木虫 (文坛精英)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
说到底,还是引物的问题,引物不对,都没用到目的带上,自己配对了,当然出现这么多二聚体咯
20楼2012-08-18 20:28:21
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海之子211

新虫 (小有名气)


引用回帖:
14楼: Originally posted by wazlf at 2011-03-16 22:48:29
我的问题解决了,谢谢大家啊!

楼主怎么解决的
21楼2013-09-11 09:35:43
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