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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR目的条带没跑出，但是跑出了特异性很强的单一条带，是什么原因呢？
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xiaoyang123

金虫 (小有名气)

[求助] PCR目的条带没跑出，但是跑出了特异性很强的单一条带，是什么原因呢？

PCR目的条带没跑出，但是跑出了特异性很强的单一条带，是什么原因呢？

其实不是很确定目的基因是否存在，如果存在，目的条带的期望长度是1300bp左右，但是跑出的单一条带却在900bp左右，而且用的是TAKARA HS Taq酶（高特异性Taq酶）……这会是什么原因造成的呢？

高特异性聚合酶是否只是防止突变，并不会减少假阳性呢？

但是跑出了单一带，怎么偏偏不是目的条带呢，太诡异了~~
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1楼 2011-11-20 22:04:03
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zlu520

至尊木虫 (职业作家)

限制人

【答案】应助回帖

xiaoyang123(金币+1): 或许是扩增不完全，可是延伸时间为2min，应该已经比较长了吧，是否有其它原因导致了扩增不完全~~ 2011-11-24 14:35:33
引用回帖:
1楼: Originally posted by xiaoyang123 at 2011-11-20 22:04:03:
PCR目的条带没跑出，但是跑出了特异性很强的单一条带，是什么原因呢？

其实不是很确定目的基因是否存在，如果存在，目的条带的期望长度是1300bp左右，但是跑出的单一条带却在900bp左右，而且用的是TAKARA HS T ...

有可能扩增不完全。。。。
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无完人！
2楼2011-11-20 23:51:40
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allmessup

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

xiaoyang123(金币+1): 又一种可能 2011-11-24 14:35:57
引用回帖:
2楼: Originally posted by zlu520 at 2011-11-20 23:51:40:
有可能扩增不完全。。。。

re~如果存在相似度高的序列片段有可能被误以为是复制终点~
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Ipsascientiapotestasest.
3楼2011-11-21 07:00:28
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moqiyilei

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xiaoyang123(金币+1): 引物在Genebank上比对匹配度都不高，是直接来自文献的，所以实验一开始就有点空中楼阁的感觉 2011-11-24 14:36:54
引物blast一下，看是否具有特异性。
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4楼2011-11-21 09:09:51
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xiaoyang123

金虫 (小有名气)
因为是根据文献合成的，当时blast并没有搜索到匹配度很高的片段，然而暂时没有更好地参照，就完全依照文献合成了。
给文章作者发过Email，他说在公开的GeneBank上可以搜索，但是我在NCBI上确实没有搜到，是否还有其它的GeneBank呢？疑惑……
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5楼2011-11-21 09:29:37
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howbigpig

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

PCR产物直接测序  （生工20块，华大25块）然后得到的序列去blast 就可以弄清楚到底是不是目的条带了
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6楼2011-11-23 16:53:54
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引物的特异性怎么样，会不会在目的基因的内部有扩增啊、、、、
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7楼2011-11-23 19:37:11
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xiaoyang123(金币+1): 不错的建议，但是引物的特异性还是无法保证~blast比对很不匹配，但是目前没有其它思路，只能按照文献给出的序列尝试一下，很多疑惑 2011-11-24 14:39:59
你可以用降落PCR的方法进行40个循环扩增，然后在目的位置进行胶回收作为模板继续PCR，前提你得保证你的引物在NCBI上blast是特异的。
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8楼2011-11-24 00:26:17
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zlu520

至尊木虫 (职业作家)

限制人

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by zlu520 at 2011-11-20 23:51:40:
有可能扩增不完全。。。。

酶没问题的话。引物也可造成。
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无完人！
9楼2011-11-24 15:58:29
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lifei13089

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也出现这种情况，可以拿去测序
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喜欢小木虫
10楼2013-09-11 16:55:43
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