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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)


[交流] 自己做的PFU高保真酶PCR,胶图如下,没有目的条带?

左边的MAKER最大是两2000,紧挨着的条带是P出来的,按MAKER比才100多,模板是1200左右的,那这些条带是什么啊?我只加了0.5ul的引物,二聚的话不会这么大吧。。。。。
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
加大模板量,做梯度PCR试试!
2楼2011-09-10 22:55:31
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wanhscn

木虫 (职业作家)


★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-09-12 08:15:00
引用回帖:
1楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-09-10 17:41:30:
左边的MAKER最大是两2000,紧挨着的条带是P出来的,按MAKER比才100多,模板是1200左右的,那这些条带是什么啊?我只加了0.5ul的引物,二聚的话不会这么大吧。。。。。
[eimg]a1/ae/1346820_1315647487_273.jpg[/e ...

目的条带多大?
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3571297&fpage=1 的4楼!
3楼2011-09-11 08:07:07
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)


引用回帖:
3楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-11 08:07:07:
目的条带多大?
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3571297&fpage=1 的4楼!

1200左右
4楼2011-09-11 09:29:20
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by zxd95 at 2011-09-10 22:55:31:
加大模板量,做梯度PCR试试!

那些条带是什么呢??
5楼2011-09-11 09:31:51
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wanhscn

木虫 (职业作家)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
loveskyzhou(金币+2): 2011-09-11 09:56:51
引用回帖:
5楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-09-11 09:31:51:
那些条带是什么呢??

短非特异性扩增产物。
6楼2011-09-11 09:39:27
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)


引用回帖:
6楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-11 09:39:27:
短非特异性扩增产物。

非特异性???!!那么亮而且整齐啊
7楼2011-09-11 09:57:24
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wanhscn

木虫 (职业作家)


★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-09-12 08:15:18
引用回帖:
7楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-09-11 09:57:24:
非特异性???!!那么亮而且整齐啊

是的,我以前扩2K的片段,一开始只能扩到500bp,后重新提基因组DNA,重新摸索扩。只要引物设计基本不差,一般优化优化都可以的。
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3571297&fpage=1
8楼2011-09-11 10:07:35
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xt123xt

银虫 (小有名气)


★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
dhd997(金币+1): 分析一下原因? 2011-09-12 08:15:33
marker就3条? 感觉像没跑开
9楼2011-09-11 10:36:05
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xt123xt

银虫 (小有名气)


★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励上图 2011-09-14 22:14:56
我没见过只有3个条带的marker 也没见过3个条带都这么偏上的跑胶 如果是短片段的话 会跑的比较下(100V 40min DL2000 第六条100bp 见图) 会不会是时间不够 或者marker不好 比如放久了 降解了 后面的条带就看不到了

10楼2011-09-12 12:33:04
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)


引用回帖:
10楼: Originally posted by xt123xt at 2011-09-12 12:33:04:
我没见过只有3个条带的marker 也没见过3个条带都这么偏上的跑胶 如果是短片段的话 会跑的比较下(100V 40min DL2000 第六条100bp 见图) 会不会是时间不够 或者marker不好 比如放久了 降解了 后面的条带就看不到了 ...

呵呵,跑的时间是短点,拍的不清楚吧 不是3条带的M。。。。。M应该没问题,所以我也觉得是P不成目的片段,只能P到那么多了。。。。
11楼2011-09-12 14:55:42
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xt123xt

银虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
那就可能是引物的问题 是用软件设计的么? prime3?
12楼2011-09-12 15:20:30
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)


引用回帖:
12楼: Originally posted by xt123xt at 2011-09-12 15:20:30:
那就可能是引物的问题 是用软件设计的么? prime3?

5....引物没问题 之前P出来过,可能是PFU高保真本来就不好P 吧
13楼2011-09-12 17:01:06
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tianliangtao

新虫 (初入文坛)


★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
loveskyzhou(金币+1): 谢谢,看了PROTOCOL 确实是 我再试试 2011-09-13 14:13:05
wanhscn(金币+5): 鼓励新虫多发帖多回帖! 2011-09-13 15:33:42
wanhscn:编辑内容 2011-09-13 15:34
同学,PFU速度很慢的,你延伸时间设置没有问题吧?一分钟500bp以内

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 15:34 ]
14楼2011-09-13 10:54:41
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
退火温度也优化下吧,有时候温度低回P出来很亮的杂带。。。
15楼2011-09-14 09:38:24
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redgrape123

金虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
建议你变性时间长一些,模板多加一些,退火温度向下降一点~
16楼2011-09-14 11:48:53
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)


★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+1): 道理是没错啊,呵呵 2011-09-14 22:15:41
看来楼主是个做实验马马虎虎的人,跑个核酸电泳Marker都能跑成这个鬼样子,只能告诉你一个经验:你糊弄实验,它也糊弄你呀!!
17楼2011-09-14 21:49:21
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yejian

铁虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
模板降到0.2ul,重新设计下引物,做个梯度PCR,应该没问题的
18楼2011-09-19 18:39:13
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