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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 自己做的PFU高保真酶PCR，胶图如下，没有目的条带？
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

[交流] 自己做的PFU高保真酶PCR，胶图如下，没有目的条带？

左边的MAKER最大是两2000，紧挨着的条带是P出来的，按MAKER比才100多，模板是1200左右的，那这些条带是什么啊？我只加了0.5ul的引物，二聚的话不会这么大吧。。。。。
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1楼2011-09-10 17:41:30
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
加大模板量，做梯度PCR试试！
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2楼2011-09-10 22:55:31
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wanhscn

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): good 2011-09-12 08:15:00
引用回帖:
1楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-09-10 17:41:30:
左边的MAKER最大是两2000，紧挨着的条带是P出来的，按MAKER比才100多，模板是1200左右的，那这些条带是什么啊？我只加了0.5ul的引物，二聚的话不会这么大吧。。。。。
[eimg]a1/ae/1346820_1315647487_273.jpg[/e ...

目的条带多大？
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3571297&fpage=1 的4楼！
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3楼2011-09-11 08:07:07
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-11 08:07:07:
目的条带多大？
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3571297&fpage=1 的4楼！

1200左右
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4楼2011-09-11 09:29:20
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zxd95 at 2011-09-10 22:55:31:
加大模板量，做梯度PCR试试！

那些条带是什么呢？？
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5楼2011-09-11 09:31:51
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wanhscn

木虫 (职业作家)
★
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loveskyzhou(金币+2): 2011-09-11 09:56:51
引用回帖:
5楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-09-11 09:31:51:
那些条带是什么呢？？

短非特异性扩增产物。
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6楼2011-09-11 09:39:27
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-11 09:39:27:
短非特异性扩增产物。

非特异性？？？！！那么亮而且整齐啊
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7楼2011-09-11 09:57:24
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wanhscn

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-09-12 08:15:18
引用回帖:
7楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-09-11 09:57:24:
非特异性？？？！！那么亮而且整齐啊

是的，我以前扩2K的片段，一开始只能扩到500bp，后重新提基因组DNA，重新摸索扩。只要引物设计基本不差，一般优化优化都可以的。
见 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3571297&fpage=1
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8楼2011-09-11 10:07:35
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xt123xt

银虫 (小有名气)
★ ★
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dhd997(金币+1): 分析一下原因？ 2011-09-12 08:15:33
marker就3条？ 感觉像没跑开
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9楼2011-09-11 10:36:05
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xt123xt

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励上图 2011-09-14 22:14:56
我没见过只有3个条带的marker 也没见过3个条带都这么偏上的跑胶 如果是短片段的话 会跑的比较下（100V 40min DL2000 第六条100bp 见图） 会不会是时间不够 或者marker不好 比如放久了 降解了 后面的条带就看不到了
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10楼2011-09-12 12:33:04
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xt123xt at 2011-09-12 12:33:04:
我没见过只有3个条带的marker 也没见过3个条带都这么偏上的跑胶 如果是短片段的话 会跑的比较下（100V 40min DL2000 第六条100bp 见图） 会不会是时间不够 或者marker不好 比如放久了 降解了 后面的条带就看不到了 ...

呵呵，跑的时间是短点，拍的不清楚吧 不是3条带的M。。。。。M应该没问题，所以我也觉得是P不成目的片段，只能P到那么多了。。。。
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11楼2011-09-12 14:55:42
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xt123xt

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
那就可能是引物的问题 是用软件设计的么? prime3?
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12楼2011-09-12 15:20:30
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by xt123xt at 2011-09-12 15:20:30:
那就可能是引物的问题 是用软件设计的么? prime3?

5....引物没问题 之前P出来过，可能是PFU高保真本来就不好P 吧
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13楼2011-09-12 17:01:06
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tianliangtao

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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loveskyzhou(金币+1): 谢谢，看了PROTOCOL 确实是 我再试试 2011-09-13 14:13:05
wanhscn(金币+5): 鼓励新虫多发帖多回帖! 2011-09-13 15:33:42
wanhscn:编辑内容 2011-09-13 15:34
同学，PFU速度很慢的，你延伸时间设置没有问题吧？一分钟500bp以内

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 15:34 ]
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14楼2011-09-13 10:54:41
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guojianping

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
退火温度也优化下吧，有时候温度低回P出来很亮的杂带。。。
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15楼2011-09-14 09:38:24
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redgrape123

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
建议你变性时间长一些，模板多加一些，退火温度向下降一点~
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16楼2011-09-14 11:48:53
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+1): 道理是没错啊，呵呵 2011-09-14 22:15:41
看来楼主是个做实验马马虎虎的人，跑个核酸电泳Marker都能跑成这个鬼样子，只能告诉你一个经验：你糊弄实验，它也糊弄你呀！！
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17楼2011-09-14 21:49:21
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yejian

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
模板降到0.2ul，重新设计下引物，做个梯度PCR，应该没问题的
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18楼2011-09-19 18:39:13
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