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flylove037新虫 (小有名气)
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[求助]
PCR高手请进，小女子有事相求，我刚来金币不要嫌少啊，我只有这么多啊，全给你了
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最近做PCR很受伤，以前P出来的体系做了很多次，出结果的概率很低。中途PCR反应试剂用完了，重新订购的（takara），引物什么的也重新订购的，同样的序列同一个公司。然后重新优化PCR体系，结果如图：1、3、5、7、9是加了模板的，2、4、6、8、10没加，两两体系是一样的除了加模板和没加模板；所有试剂都一样，做了一个Mg离子梯度：2、3、4、5、6微升，原以为找到了原因，今天用6微升Mg离子的做了4批，一管都没有，桑心啊~~~哪位高人可以帮帮我啊，小女子不甚感激啊~~~~~ 试剂什么的应该没有问题的，因为其他同学做别的分子标记也做得出的。  |
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 【分子生物】EPI帖 |
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wanhscn
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 2011-09-07 11:15:48
dhd997(金币+2): 楼主奖励 2011-09-07 17:20:33
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 2011-09-07 11:15:48
dhd997(金币+2): 楼主奖励 2011-09-07 17:20:33
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Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles. From Yale University （这个是我以前做等位特异PCR的时候参考过，你可以参照问题3 ） 1. I get (many) longer unspecific products. What can I do? 扩增出比较长的非特异性产物？ Decrease annealing time减少退火时间 Increase annealing temperature升高退火温度 Decrease extension time减少延伸时间 Decrease extension temperature to 62-68º C降低延伸温度到62-68º C Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM.增加KCl浓度到1.2-2.0倍，但是保持MgCl2浓度在1.5-2.0mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant.增加MgCl2浓度到3-4.5 mM，但是保持dNTP浓度不变。 Take less primer减少引物 Take less DNA template减少DNA模板浓度 Take less Taq polymerase少用些Taq酶 If none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s)如上诉无效果：核对引物的重复序列和换引物 Combine some/all of the above 上诉方法灵活使用 -------------------------------------------------------------------------------- 2. I get (many) shorter unspecific products. What can I do? 扩增出比较短的非特异性产物 Increase annealing temperature升高退火温度 Increase annealing time增加退火时间 Increase extension time增加延伸时间 Increase extension temperature to 74-78º C增加延伸温度到74-78º C Decrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM减少KCl浓度至0.7-0.8倍，但是保持MgCl2浓度在1.5-2mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant增加MgCl2浓度到3-4.5 mM但是保持dNTP浓度不变 Take less primer少用引物 Take less DNA template少用模板 Take less Taq polymerase少用酶 If none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s)同第一问题 Combine some/all of the above -------------------------------------------------------------------------------- 3. Reaction was working before, but now I can't get any product. 反应以前有产物，可是现在不行。 Make sure all PCR ingredients are taken in the reaction (buffer, template, Taq, etc)确保反应所有的成分都存在 Change the dNTP solution (very sensitive to cycles of thawing and freezing, especially in multiplex PCR)更换dNTP溶液 If you just bought new primers, check for their reliability (bad primer synthesis ?)新引物要保持其合成的准确可靠性 Increase primer amount增加引物的量 Increase template amount增加模板的量 Decrease annealing temperature by 6-10º C and check if you get any product. If you don't, check all your PCR ingredients. If you do get products (including unspecific ones) reaction conditions as described above.将退火温度降低6-10º C后核对一下是否有产物，如果没有就确认一下PCR反应的成分是否都存在。如果能获得产物（包括非特异性的产物）然后采取上诉方法。 Combine some/all of the above 4. My PCR product is weak. Is there a way to increase the yield? PCR的产物的量很少，怎样增加产量? -------------------------------------------------------------------------------- Gradually decrease the annealing temperature to the lowest possible.逐渐降低退火温度到最大可能 Increase the amount of PCR primer增加引物的量 Increase the amount of DNA template增加模板的量 Increase the amount of Taq polymerase增加酶的量 Change buffer (KCl) concentration (higher if product is lower than 1000bp or lower if product is higher than 1000bp)改变buffer中KCL的浓度（增加如果产物少于1000bp，减少如果大于1000bp） Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol.加入辅佐剂。最好用BSA。或者用5%的二甲基亚砜 Check primer sequences for mismatches and/or increase the primer length by 5 nucleotides核对一下一物种错配的，或者增加5个核苷酸 Combine some/all of the above 5. My two primers have very different melting temperatures (Tm) but I cannot change their locus. What can I do to improve PCR amplification? 两个引物的溶解温度非常不一样但不能改变基因座。如何改进？ -------------------------------------------------------------------------------- An easy solution is to increase the length of the primer with low Tm. If you need to keep the size of the product constant, add a few bases at the 3' end. If size is not a concern, add a few bases at either the 3' or the 5' end of that primer.增加低溶解温度的长度。 [ Last edited by wanhscn on 2011-9-6 at 22:32 ] |
4楼2011-09-06 22:23:33
cdl007
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 我也经常用你这个体系。 2011-09-06 22:20:01
wanhscn(金币+3): 我也经常用你这个体系。 2011-09-06 22:20:01
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6ul mg？多大体系？通常我的PCR 20ul的话，是2.5ul ~3 ul之间， 看上去你选那个 4 ul的就不错啊。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
flylove0373楼2011-09-06 21:33:20
wanhscn
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dhd997(金币+3): good 2011-09-12 08:24:05
dhd997(金币+3): good 2011-09-12 08:24:05
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优化的时候是怎么优化的？是用移液器一个PCR管一个PCR管的加反应试剂，还是配5-10个反应的反应液，然后混合再加；前者单个加，尤其是酶加不准。加6微升镁离子，感觉太多了。 再做一次，注意不能漏加。我看3ul就差不多。 |
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2楼2011-09-06 21:25:15
【答案】应助回帖
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-07 11:19:08
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-07 11:19:08
| 看不到图，不知道你镁离子的浓度是多少6ul的话，一般是25mm的，再加上你的体系可能是25ul的？那终浓度就是6mm，对于普通PCR来说虽然有点高，但是不至于会扩不出来 |
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5楼2011-09-07 09:13:32
imfly77
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西瓜(金币+3): 深表同意！做分子4年多，本人和身边的人从来没优化过镁离子浓度！ 2011-09-07 15:42:05
西瓜(金币+3): 深表同意！做分子4年多，本人和身边的人从来没优化过镁离子浓度！ 2011-09-07 15:42:05
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话说我读博士的时候，我老板最看不起国内一些研究生的就是做PCR喜欢优化Mg离子浓度，深以为然。 用哪种酶就用那种酶配的缓冲液，按protocol上给的标准体系和程序加样和反应，除了某些高GC体系需要注意，一般的PCR反应都不会有什么问题。如果出问题了，检查自己的程序是否有错误，检查反应体系中是否加错或者漏加，是否拿错了反应buffer——很容易发生的错误是把dNTP加错，因为有时候也可能用dCTP或者dTTP，以及把buffer加错（默认的缓冲buffer都是带有Mg2+的，但不排除有不带Mg的，这类buffer都会注明-Mg2+）。 别把自己的时间浪费在这种低质量、繁琐的优化上，要相信这部分优化商家已经帮你做好了——以前曾听说有个同学做了两个学期的PCR条件优化，最后写了一篇论文就是关于怎样做好PCR，让人无语。 |
6楼2011-09-07 13:53:52
flylove037
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7楼2011-09-07 14:18:44
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8楼2011-09-07 14:32:27
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9楼2011-09-07 14:37:19
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