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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR高手请进，小女子有事相求，我刚来金币不要嫌少啊，我只有这么多啊，全给你了
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flylove037

新虫 (小有名气)
坑爹啊，上、下游引物一个亮一个暗
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11楼2011-09-07 15:05:20
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
wanhscn(金币+1): 鼓励回帖交流 2011-09-07 16:16:59
不行的话楼主就买那种预混的酶吧。比如tiangen公司的taq plus，所有成分都是预先混合在一起的，不用自己优化的。
我感觉现在PCR，跟试剂关系不大，现在的试剂质量那都是相当的好。关键要优化的就是退火温度，引物设计的有没有问题等。
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生物资源交流QQ群：1044518333
12楼2011-09-07 15:10:56
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flylove037

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by snoopyzxx at 2011-09-07 15:10:56:
不行的话楼主就买那种预混的酶吧。比如tiangen公司的taq plus，所有成分都是预先混合在一起的，不用自己优化的。
我感觉现在PCR，跟试剂关系不大，现在的试剂质量那都是相当的好。关键要优化的就是退火温度，引物 ...

嗯，谢谢啊，我以前做PCR都挺好的，我今天跑了一下上下游引物，一个亮一个暗，它这样的浓度不均也对反应有影响的吧
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13楼2011-09-07 15:36:22
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★
西瓜(金币+1): Good 2011-11-30 20:20:28
引用回帖:
6楼: Originally posted by imfly77 at 2011-09-07 13:53:52:
话说我读博士的时候，我老板最看不起国内一些研究生的就是做PCR喜欢优化Mg离子浓度，深以为然。
用哪种酶就用那种酶配的缓冲液，按protocol上给的标准体系和程序加样和反应，除了某些高GC体系需要注意，一般的P ...

有道理。看专业。但如果做多倍体物种，以及多倍体物质gene的图位克隆，有些在没有其他可选择的情况下，还是要优化的。
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真相是最大的奢侈品
14楼2011-09-07 16:06:49
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
引用回帖:
8楼: Originally posted by flylove037 at 2011-09-07 14:32:27:
是因为试了很多情况都做不出来才迫不得已优化的啊，谁会没事找抽搞体系优化啊，我们导师也很藐视方法上的所谓改进的，把这个方法写进文章这种事情是做不出来的，那个只是我们试验中的困难，你举的那个例子就太夸 ...

也不全是这样的，看学科专业。对于多倍体物种，一个基因有几个同源拷贝的情况下，还是需要优化体系的。新手都需要从优化这步做起。
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真相是最大的奢侈品
15楼2011-09-07 16:14:29
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★ ★
西瓜(金币+2): Good 2011-11-30 20:20:47
引用回帖:
8楼: Originally posted by flylove037 at 2011-09-07 14:32:27:
是因为试了很多情况都做不出来才迫不得已优化的啊，谁会没事找抽搞体系优化啊，我们导师也很藐视方法上的所谓改进的，把这个方法写进文章这种事情是做不出来的，那个只是我们试验中的困难，你举的那个例子就太夸 ...

也不全是这样的，看学科专业。对于多倍体物种，一个基因有几个同源拷贝的情况下，还是需要优化体系的。新手都需要从优化这步做起。
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flylove037
真相是最大的奢侈品
16楼2011-09-07 16:14:49
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cyz20050505

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): good，不能一味相信软件。 2011-09-07 17:22:42
话说以我的经验做PCR根本用不去动镁离子浓度，凡事都有主要次要因素，镁离子就是个次要因素，引物状态和参数就是一个主要因素，一次跑个梯度看结果，不行就重新设计条好的引物，普通PCR哪有扩不出来的道理。引物的好坏，绝大多数人以为是primer5或者oligo6给出的参数，实际上那些参数尤其是TM值是不太可信，设计引物重点考察3端6个碱基的状态，因为对整条引物来说只有这6个碱基才会被聚合酶所覆盖从而延伸。楼主既然以前扩出来，现在同样的东西就扩不出来，如果排除你实验操作或者试剂差错，我严重怀疑引物的实际效率，也就是说引物本身状态不稳当，导致PCR反应极易受到各种因素的影响，所以时又时无。
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flylove037
17楼2011-09-07 17:01:00
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flylove037

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by cyz20050505 at 2011-09-07 17:01:00:
话说以我的经验做PCR根本用不去动镁离子浓度，凡事都有主要次要因素，镁离子就是个次要因素，引物状态和参数就是一个主要因素，一次跑个梯度看结果，不行就重新设计条好的引物，普通PCR哪有扩不出来的道理。引物的 ...

高手就是高手，确实是引物的问题，我昨天把上下游引物跑了一下，结果一条亮一条暗，原液浓度就不一样，这样的话是不是证明我扩不出引物是罪魁祸首啊
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18楼2011-09-08 12:32:02
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flylove037

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-07 16:14:49:
也不全是这样的，看学科专业。对于多倍体物种，一个基因有几个同源拷贝的情况下，还是需要优化体系的。新手都需要从优化这步做起。

嗯，谢谢，我懂了，要分情况的，呵呵~~~谢谢~~~再送你一朵花~~~
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19楼2011-09-08 12:38:16
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liuchenammk

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+8): 鼓励新虫踊跃发帖，回帖，中秋节特给金币10个！ 2011-09-12 14:54:52
wanhscn(金币+2): 欢迎常来分子生物版！ 2011-09-12 14:55:55
向师兄师姐们学习！！！
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20楼2011-09-12 13:50:06
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