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flylove037新虫 (小有名气)
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[求助]
PCR高手请进，小女子有事相求，我刚来金币不要嫌少啊，我只有这么多啊，全给你了
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最近做PCR很受伤，以前P出来的体系做了很多次，出结果的概率很低。中途PCR反应试剂用完了，重新订购的（takara），引物什么的也重新订购的，同样的序列同一个公司。然后重新优化PCR体系，结果如图：1、3、5、7、9是加了模板的，2、4、6、8、10没加，两两体系是一样的除了加模板和没加模板；所有试剂都一样，做了一个Mg离子梯度：2、3、4、5、6微升，原以为找到了原因，今天用6微升Mg离子的做了4批，一管都没有，桑心啊~~~哪位高人可以帮帮我啊，小女子不甚感激啊~~~~~ 试剂什么的应该没有问题的，因为其他同学做别的分子标记也做得出的。  |
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 【分子生物】EPI帖 |
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cyz20050505
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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wanhscn(金币+1): good，不能一味相信软件。 2011-09-07 17:22:42
wanhscn(金币+1): good，不能一味相信软件。 2011-09-07 17:22:42
| 话说以我的经验做PCR根本用不去动镁离子浓度，凡事都有主要次要因素，镁离子就是个次要因素，引物状态和参数就是一个主要因素，一次跑个梯度看结果，不行就重新设计条好的引物，普通PCR哪有扩不出来的道理。引物的好坏，绝大多数人以为是primer5或者oligo6给出的参数，实际上那些参数尤其是TM值是不太可信，设计引物重点考察3端6个碱基的状态，因为对整条引物来说只有这6个碱基才会被聚合酶所覆盖从而延伸。楼主既然以前扩出来，现在同样的东西就扩不出来，如果排除你实验操作或者试剂差错，我严重怀疑引物的实际效率，也就是说引物本身状态不稳当，导致PCR反应极易受到各种因素的影响，所以时又时无。 |
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flylove03717楼2011-09-07 17:01:00