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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者

[求助] 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除

我现在一直做qPCR.,但RNA的DNA一直除不净，我采取了一下步骤，但DNA依然无法除尽：
     1 加入氯仿后，离心后400多微升的上清我只取200微升
     2 得到RNA后，我加入DNase1除DNA ，50微升加5微升，反应时间为1hour
    但最后进行PCR检验，用16S v3-V5区（我做的是细菌）的引物，进行PCR, 31cycles，最后发现除DNA的RNA中仍然p出条带
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人的上半生不要犹豫，下半生不要后悔
1楼 2012-02-14 21:37:38
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
引用回帖:
楼: Originally posted by hongyz at 2012-02-16 09:33:59:
处理2次就好了，我们一直这么做。

还有一个问题就是为什么要分两次加，难道Dnase的活性在反应体系中很容易失火吗？谢谢了
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14楼2012-02-16 16:59:29
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
引用回帖:
楼: Originally posted by longrna at 2012-02-16 12:46:54:
同意6楼。
首先选择好Trizol肯定重要。如果能在提取过程就把绝大部分的DNA去除，那肯定好。
去DNA确实很难彻底去除，因为你用PCR的方法来检测是一个很灵敏的检测方法。有条件建议用进口的DNase I ，反应时酶分两 ...

再请教你一个问题：为什么要分两次加酶，难道Dnase的活性在反应体系中很容易失货吗？谢谢了酶的量和反应时间分别多少？
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15楼2012-02-16 17:01:09
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guangmingzhizi

铁虫 (初入文坛)
PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)
takara的，这个应该很适合你的。
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qingtingzhe
我的blog：http://vipbio.bokee.com
6楼2012-02-15 15:33:45
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
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引用回帖:
2楼: Originally posted by flyer8666 at 2012-02-14 21:50:34:
DNase是需要DNase buffer的，且RNA的量不要加的太多，具体要看DNase的说明书，可适当延长DNase消化的时间，可以消化1h之后再补加一点DNase

说明书中50微升体系中加2微升酶，反应时间为20-30分钟，如果基因组DNA没有出去，说明书中建议增加酶量或延长反应时间，于是我将酶加大到5微升，时间延长到1个小时，但用PCR验证，发现仍有微弱的条带。说明书如下：
1. 在微量离心管中配制下列反应液，全量50 μl。

全RNA         20～50 μg
10×DNase I Buffer 5  μl
Recombinant DNase I（RNase-free，5 U/μl）     2  μl  
RNase Inhibitor（40 U/μl）               20 Units
DEPC-treated water                     up to 50  μl

2.  37℃反应20～30分钟。  
3.  使用以下两种方法使Recombinant DNase I失活。  
A．热处理  
（1） 加入2.5 μl 0.5 M EDTA，混匀，80℃加热处理2 min。   
（2） 用RNase Free dH2O定容至100 μl。  
B．苯酚/氯仿抽提  
（1） 用50 μl RNase Free dH2O定容至100 μl后加入等体
积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀。  
（2） 室温，12,000 rpm离心5 min，取上清。  
（3） 加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。  
（4） 室温，12,000 rpm离心5 min，取上清。  
4.  加入10 μl 3 M醋酸钠和250 μl冷乙醇，-80℃放置20 min。  
5.  4℃，12,000 rpm离心10 min，弃上清。  
6.  加入70%冷乙醇洗净，4℃，12,000 rpm离心5 min，弃上清。   
7.  沉淀干燥。  
8.  用适量的RNase Free dH2O溶解后， 进行Agarose 电泳确认是
否除去基因组 DNA，同时测定 RNA 的浓度。如果基因组 DNA
没有被完全除去，可以适当增加Recombinant DNase I(RNase
-free)的添加量或者延长反应时间。 想请教你几个问题
（1）说明书中在用DNase1 处理完后，我是直接80度，10分钟处理。而说明书在加了很多步骤（3-8步骤），不知3-8步骤的作用是什么？我的处理对结果会产生什么影响？
（2)你在答复中提到消化1h之后再补加一点DNase ，为什么不在开始时就多加点酶呢？难道酶很容易失火？
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3楼2012-02-15 11:51:10
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7788945

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3): good 2012-02-16 13:41:11
qingtingzhe(金币+10): ★有帮助 2012-02-16 16:40:18
qingtingzhe(金币+10): ★有帮助 谢谢了 2012-02-20 11:18:23
有没有在提取完RNA后跑个胶试一试？个人认为RNA提取的试剂有一定关系，我以前买生工的trizol，提出的rna里DNA较多，后来用invitrogen的trizol效果还不错，就是贵点，至少在电泳检测的时候没看到DNA的条带，不知道你用的是哪个公司的试剂，或者是自己配的提取液。你说的取上清时候减量的确很必要。
DNaseI处理后也应该跑一下。
至于你说的用16S去P还能有条带，会不会是有污染呢？即便可能性比较小也可以考虑下。
DNaseI说明书里的3-8是两个方法，看你说的意思是你用的热处理法，这个方法不推荐，因为里边加的EDTA可能会影响你后续步骤，至少我以前用这个方法处理后P不出条带来，同样条件的酚仿抽提则可以，但是这个方法会让你的RNA损耗很多，可以先多提点RNA，预备出损失的量，不过反转也用不了多少。
希望可以帮到你。
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qingtingzhe
7楼2012-02-15 19:01:32
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普通回帖

flyer8666

新虫 (初入文坛)
DNase是需要DNase buffer的，且RNA的量不要加的太多，具体要看DNase的说明书，可适当延长DNase消化的时间，可以消化1h之后再补加一点DNase
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qingtingzhe
2楼2012-02-14 21:50:34
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
引用回帖:
2楼: Originally posted by flyer8666 at 2012-02-14 21:50:34:
DNase是需要DNase buffer的，且RNA的量不要加的太多，具体要看DNase的说明书，可适当延长DNase消化的时间，可以消化1h之后再补加一点DNase

下次请点应助回帖，方便给你金币，谢谢了！
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4楼2012-02-15 11:53:43
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lhbqingfeng

新虫 (初入文坛)

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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3): 鼓励新虫回帖应助 2012-02-16 13:40:39
qingtingzhe(金币+5): ★有帮助 2012-02-16 16:38:28
1、DNase1直接80度10分钟处理是不能完全灭活的。
2、加入DNase1除DNA 时，加入的酶量是多少？其实，酶切的时间更为关键，一般1U的DNase1在1hour能除去的DNA有限。建议延长时间到5小时或更长。
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qingtingzhe
5楼2012-02-15 14:40:32
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hongyz

铁杆木虫 (正式写手)

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qingtingzhe(金币+10): ★有帮助 2012-02-16 16:59:41
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qingtingzhe
会选择，会放弃；会思想，会追求
8楼2012-02-16 09:33:59
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longrna

新虫 (正式写手)
小丹木木(金币+2): 鼓励交流 2012-02-16 13:41:56
同意6楼。
首先选择好Trizol肯定重要。如果能在提取过程就把绝大部分的DNA去除，那肯定好。
去DNA确实很难彻底去除，因为你用PCR的方法来检测是一个很灵敏的检测方法。有条件建议用进口的DNase I ，反应时酶分两次加，延长处理时间尝试。
如果可以，尽量设计一些跨内含子的引物免得痕量的DNA在你实验中作怪。
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伟大航线....
9楼2012-02-16 12:46:54
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longrna

新虫 (正式写手)
不好意思，应该是同意7楼。
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伟大航线....
10楼2012-02-16 12:48:04
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