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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

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楼: Originally posted by lhbqingfeng at 2012-02-15 14:40:32:
1、DNase1直接80度10分钟处理是不能完全灭活的。
2、加入DNase1除DNA 时，加入的酶量是多少？其实，酶切的时间更为关键，一般1U的DNase1在1hour能除去的DNA有限。建议延长时间到5小时或更长。

谢谢 给的建议
1 说明书中有两种灭火的方法其中一种为A．热处理  
（1） 加入2.5 μl 0.5 M EDTA，混匀，80℃加热处理2 min。   
（2） 用RNase Free dH2O定容至100 μl。
因为我看论坛上说80度10分钟也可以灭火，跟说明书中的类似，只是没有加0.5 M EDTA。感觉2.5 μl 0.5 M EDTA很难配，容易有RNA酶污染。希望高手提供个方法.感激不尽!
2 至于酶量。说明书中50微升体系中加2微升酶，反应时间为20-30分钟，如果基因组DNA没有出去，说明书中建议增加酶量或延长反应时间，于是我将酶加大到5微升，时间延长到1个小时。但时间过长会导致RNA降解，5个小时RNA估计没多少了
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11楼2012-02-16 15:26:19
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

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楼: Originally posted by 7788945 at 2012-02-15 19:01:32:
有没有在提取完RNA后跑个胶试一试？个人认为RNA提取的试剂有一定关系，我以前买生工的trizol，提出的rna里DNA较多，后来用invitrogen的trizol效果还不错，就是贵点，至少在电泳检测的时候没看到DNA的条带，不知道 ...

1 我所用的所有试剂都是takara（日本），感觉试剂不是太大的问题。我电泳后也没发现明显的问条带，应该残余量很低。
2 DNaseI处理后应该跑一下是看有没有DNA条带吗 如果RNA电泳没有条带的话，这一步是不是可以不用电泳。
3 你是说引物有污染吗 我可以重新稀释引物
4 说明书中第3-8步是变性DNase,然后通过抽提出去DNase。如果DNAase只是变性，不抽提出去，对后续的实验有没有影响？抽提除酶的步骤很繁琐，并且用到的很多试剂，很容易有RNase污染。
谢谢了
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12楼2012-02-16 16:27:21
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qingtingzhe

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楼: Originally posted by hongyz at 2012-02-16 09:33:59:
处理2次就好了，我们一直这么做。

（1)说明书中50微升体系中加2微升酶，反应时间为20-30分钟，如果基因组DNA没有出去，说明书中建议增加酶量或延长反应时间。我将酶加大到5微升，时间延长到1个小时，然后再重复一次。酶的量和反应时间可以吗？
(2) 请问你们是怎么进行DNase 变性和出去的？是使用说明书中的方法吗？
谢谢了
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13楼2012-02-16 16:47:55
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楼: Originally posted by hongyz at 2012-02-16 09:33:59:
处理2次就好了，我们一直这么做。

还有一个问题就是为什么要分两次加，难道Dnase的活性在反应体系中很容易失火吗？谢谢了
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14楼2012-02-16 16:59:29
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qingtingzhe

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楼: Originally posted by longrna at 2012-02-16 12:46:54:
同意6楼。
首先选择好Trizol肯定重要。如果能在提取过程就把绝大部分的DNA去除，那肯定好。
去DNA确实很难彻底去除，因为你用PCR的方法来检测是一个很灵敏的检测方法。有条件建议用进口的DNase I ，反应时酶分两 ...

再请教你一个问题：为什么要分两次加酶，难道Dnase的活性在反应体系中很容易失货吗？谢谢了酶的量和反应时间分别多少？
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15楼2012-02-16 17:01:09
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7788945

银虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by qingtingzhe at 2012-02-16 16:27:21:
1 我所用的所有试剂都是takara（日本），感觉试剂不是太大的问题。我电泳后也没发现明显的问条带，应该残余量很低。
2 DNaseI处理后应该跑一下是看有没有DNA条带吗 如果RNA电泳没有条带的话，这一步是不是可以不 ...

1 takara的试剂也不侧重于提取RNA，他们在说明书上所给出的效果图我们不知道是怎么做出来的，可能用的材料比较容易提取，而到了各个实验室所用的材料不一样，可能效果就不如他们所承诺的。提完的RNA里没有明显的DNA条带的话应该比较少，但即使少也应该除去，除非你设计的引物跨了较大内含子，那样的话不除那点少量的DNA也没什么问题。
2 我做的时候处理完跑了一下，的确效果很明显，如果原本就少的话处理完可以不跑，但是处理完了RNA是不是会有降解？多这一步不是没有好处。
3 我说的污染其实不太可能，按理说除了模板外其他的不太可能有什么污染了，引物当然也是，要不就按照其他人回复的换个引物试试，或者直接再设计一对引物，跨内含子，省去其他的麻烦了。
4 3-8不是全都得做，以前的RNsaeI说明书里只有酚仿抽提的方法，没有那个热处理。但现在加上了，可能公司在实验的时候这样做可以，但我是没做出来，灭活的酶在里边可能没影响，反转录完酶不也只是灭活不用除掉么。抽提的确很繁琐，而且损失很大，你可以试试啊，只用热处理，然后反转看看能不能行。
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16楼2012-02-18 17:42:41
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qingtingzhe

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楼: Originally posted by guangmingzhizi at 2012-02-15 15:33:45:
PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)
takara的，这个应该很适合你的。

谢谢了 这个试剂盒除DNA效果不错吧
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17楼2012-02-20 16:21:26
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jinlingmen

新虫 (初入文坛)
我也用的TaKaRa，刚开始做的时候也是消化完用16S引物能P出条带，后来发现DNA酶只消化了离心管最底部的DNA，还有一些DNA可能粘在上面的侧臂上，没有接触到DNA酶，而后面纯化RNA时，又将这部分没有消化过的DNA一起混进去了。以后我每次消化时都换一个新的离心管，然后按提RNA的步骤从加氯仿那一步开始重提一次。我觉得少用几种试剂应该会减少RNA的降解。
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18楼2012-04-04 12:06:19
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z372818207

金虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by qingtingzhe at 2012-02-15 11:51:10
说明书中50微升体系中加2微升酶，反应时间为20-30分钟，如果基因组DNA没有出去，说明书中建议增加酶量或延长反应时间，于是我将酶加大到5微升，时间延长到1个小时，但用PCR验证，发现仍有微弱的条带。说明书如下： ...

我也想买这个酶，但是看到里面有RNase Inhibitor，可说明书上又没有附赠这个，不知道这个是从哪买？望解答~
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做好自己
19楼2014-05-27 11:28:52
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