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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者

[求助] 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除

我现在一直做qPCR.,但RNA的DNA一直除不净，我采取了一下步骤，但DNA依然无法除尽：
     1 加入氯仿后，离心后400多微升的上清我只取200微升
     2 得到RNA后，我加入DNase1除DNA ，50微升加5微升，反应时间为1hour
    但最后进行PCR检验，用16S v3-V5区（我做的是细菌）的引物，进行PCR, 31cycles，最后发现除DNA的RNA中仍然p出条带
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人的上半生不要犹豫，下半生不要后悔
1楼 2012-02-14 21:37:38
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by qingtingzhe at 2012-02-16 16:27:21:
1 我所用的所有试剂都是takara（日本），感觉试剂不是太大的问题。我电泳后也没发现明显的问条带，应该残余量很低。
2 DNaseI处理后应该跑一下是看有没有DNA条带吗 如果RNA电泳没有条带的话，这一步是不是可以不 ...

1 takara的试剂也不侧重于提取RNA，他们在说明书上所给出的效果图我们不知道是怎么做出来的，可能用的材料比较容易提取，而到了各个实验室所用的材料不一样，可能效果就不如他们所承诺的。提完的RNA里没有明显的DNA条带的话应该比较少，但即使少也应该除去，除非你设计的引物跨了较大内含子，那样的话不除那点少量的DNA也没什么问题。
2 我做的时候处理完跑了一下，的确效果很明显，如果原本就少的话处理完可以不跑，但是处理完了RNA是不是会有降解？多这一步不是没有好处。
3 我说的污染其实不太可能，按理说除了模板外其他的不太可能有什么污染了，引物当然也是，要不就按照其他人回复的换个引物试试，或者直接再设计一对引物，跨内含子，省去其他的麻烦了。
4 3-8不是全都得做，以前的RNsaeI说明书里只有酚仿抽提的方法，没有那个热处理。但现在加上了，可能公司在实验的时候这样做可以，但我是没做出来，灭活的酶在里边可能没影响，反转录完酶不也只是灭活不用除掉么。抽提的确很繁琐，而且损失很大，你可以试试啊，只用热处理，然后反转看看能不能行。
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16楼2012-02-18 17:42:41
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flyer8666

新虫 (初入文坛)
DNase是需要DNase buffer的，且RNA的量不要加的太多，具体要看DNase的说明书，可适当延长DNase消化的时间，可以消化1h之后再补加一点DNase
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qingtingzhe
2楼2012-02-14 21:50:34
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
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引用回帖:
2楼: Originally posted by flyer8666 at 2012-02-14 21:50:34:
DNase是需要DNase buffer的，且RNA的量不要加的太多，具体要看DNase的说明书，可适当延长DNase消化的时间，可以消化1h之后再补加一点DNase

说明书中50微升体系中加2微升酶，反应时间为20-30分钟，如果基因组DNA没有出去，说明书中建议增加酶量或延长反应时间，于是我将酶加大到5微升，时间延长到1个小时，但用PCR验证，发现仍有微弱的条带。说明书如下：
1. 在微量离心管中配制下列反应液，全量50 μl。

全RNA         20～50 μg
10×DNase I Buffer 5  μl
Recombinant DNase I（RNase-free，5 U/μl）     2  μl  
RNase Inhibitor（40 U/μl）               20 Units
DEPC-treated water                     up to 50  μl

2.  37℃反应20～30分钟。  
3.  使用以下两种方法使Recombinant DNase I失活。  
A．热处理  
（1） 加入2.5 μl 0.5 M EDTA，混匀，80℃加热处理2 min。   
（2） 用RNase Free dH2O定容至100 μl。  
B．苯酚/氯仿抽提  
（1） 用50 μl RNase Free dH2O定容至100 μl后加入等体
积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀。  
（2） 室温，12,000 rpm离心5 min，取上清。  
（3） 加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。  
（4） 室温，12,000 rpm离心5 min，取上清。  
4.  加入10 μl 3 M醋酸钠和250 μl冷乙醇，-80℃放置20 min。  
5.  4℃，12,000 rpm离心10 min，弃上清。  
6.  加入70%冷乙醇洗净，4℃，12,000 rpm离心5 min，弃上清。   
7.  沉淀干燥。  
8.  用适量的RNase Free dH2O溶解后， 进行Agarose 电泳确认是
否除去基因组 DNA，同时测定 RNA 的浓度。如果基因组 DNA
没有被完全除去，可以适当增加Recombinant DNase I(RNase
-free)的添加量或者延长反应时间。 想请教你几个问题
（1）说明书中在用DNase1 处理完后，我是直接80度，10分钟处理。而说明书在加了很多步骤（3-8步骤），不知3-8步骤的作用是什么？我的处理对结果会产生什么影响？
（2)你在答复中提到消化1h之后再补加一点DNase ，为什么不在开始时就多加点酶呢？难道酶很容易失火？
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人的上半生不要犹豫，下半生不要后悔
3楼2012-02-15 11:51:10
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

步行者
引用回帖:
2楼: Originally posted by flyer8666 at 2012-02-14 21:50:34:
DNase是需要DNase buffer的，且RNA的量不要加的太多，具体要看DNase的说明书，可适当延长DNase消化的时间，可以消化1h之后再补加一点DNase

下次请点应助回帖，方便给你金币，谢谢了！
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人的上半生不要犹豫，下半生不要后悔
4楼2012-02-15 11:53:43
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