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qingtingzhe银虫 (正式写手)
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[求助]
请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
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我现在一直做qPCR.,但RNA的DNA一直除不净，我采取了一下步骤，但DNA依然无法除尽： 1 加入氯仿后，离心后400多微升的上清我只取200微升 2 得到RNA后，我加入DNase1除DNA ，50微升加5微升，反应时间为1hour 但最后进行PCR检验，用16S v3-V5区（我做的是细菌）的引物，进行PCR, 31cycles，最后发现除DNA的RNA中仍然p出条带 |
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 核酸生物学实验经验 | RNA提取 |
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guangmingzhizi
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PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time) takara的，这个应该很适合你的。 |
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6楼2012-02-15 15:33:45
qingtingzhe
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说明书中50微升体系中加2微升酶，反应时间为20-30分钟，如果基因组DNA没有出去，说明书中建议增加酶量或延长反应时间，于是我将酶加大到5微升，时间延长到1个小时，但用PCR验证，发现仍有微弱的条带。说明书如下： 1. 在微量离心管中配制下列反应液，全量50 μl。 全RNA 20～50 μg 10×DNase I Buffer 5 μl Recombinant DNase I（RNase-free，5 U/μl） 2 μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 20 Units DEPC-treated water up to 50 μl 2. 37℃反应20～30分钟。 3. 使用以下两种方法使Recombinant DNase I失活。 A．热处理 （1） 加入2.5 μl 0.5 M EDTA，混匀，80℃加热处理2 min。 （2） 用RNase Free dH2O定容至100 μl。 B．苯酚/氯仿抽提 （1） 用50 μl RNase Free dH2O定容至100 μl后加入等体 积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀。 （2） 室温，12,000 rpm离心5 min，取上清。 （3） 加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。 （4） 室温，12,000 rpm离心5 min，取上清。 4. 加入10 μl 3 M醋酸钠和250 μl冷乙醇，-80℃放置20 min。 5. 4℃，12,000 rpm离心10 min，弃上清。 6. 加入70%冷乙醇洗净，4℃，12,000 rpm离心5 min，弃上清。 7. 沉淀干燥。 8. 用适量的RNase Free dH2O溶解后， 进行Agarose 电泳确认是 否除去基因组 DNA，同时测定 RNA 的浓度。如果基因组 DNA 没有被完全除去，可以适当增加Recombinant DNase I(RNase -free)的添加量或者延长反应时间。 想请教你几个问题 （1）说明书中在用DNase1 处理完后，我是直接80度，10分钟处理。而说明书在加了很多步骤（3-8步骤），不知3-8步骤的作用是什么？我的处理对结果会产生什么影响？ （2)你在答复中提到消化1h之后再补加一点DNase ，为什么不在开始时就多加点酶呢？难道酶很容易失火？ |
3楼2012-02-15 11:51:10
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有没有在提取完RNA后跑个胶试一试？个人认为RNA提取的试剂有一定关系，我以前买生工的trizol，提出的rna里DNA较多，后来用invitrogen的trizol效果还不错，就是贵点，至少在电泳检测的时候没看到DNA的条带，不知道你用的是哪个公司的试剂，或者是自己配的提取液。你说的取上清时候减量的确很必要。 DNaseI处理后也应该跑一下。 至于你说的用16S去P还能有条带，会不会是有污染呢？即便可能性比较小也可以考虑下。 DNaseI说明书里的3-8是两个方法，看你说的意思是你用的热处理法，这个方法不推荐，因为里边加的EDTA可能会影响你后续步骤，至少我以前用这个方法处理后P不出条带来，同样条件的酚仿抽提则可以，但是这个方法会让你的RNA损耗很多，可以先多提点RNA，预备出损失的量，不过反转也用不了多少。 希望可以帮到你。 |
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7楼2012-02-15 19:01:32
| DNase是需要DNase buffer的，且RNA的量不要加的太多，具体要看DNase的说明书，可适当延长DNase消化的时间，可以消化1h之后再补加一点DNase |
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2楼2012-02-14 21:50:34
qingtingzhe
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4楼2012-02-15 11:53:43
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1、DNase1直接80度10分钟处理是不能完全灭活的。 2、加入DNase1除DNA 时，加入的酶量是多少？其实，酶切的时间更为关键，一般1U的DNase1在1hour能除去的DNA有限。建议延长时间到5小时或更长。 |
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5楼2012-02-15 14:40:32
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| 处理2次就好了，我们一直这么做。 |
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