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yuyan225

金虫 (小有名气)

[求助] 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题

各位虫友大家好，我最近初做RTPCR，想请教一下高手是不是用于RTPCR的每对引物使用前都得进行模板为水的空白对照实验，以确定后期熔解曲线的峰是不是出现了特异性扩增，望高手解答，谢谢！！
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1楼 2011-06-17 17:10:30
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yuyan225(金币+3): 2011-06-18 16:59:44
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-18 21:53:39
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-06-17 17:10:30:
各位虫友大家好，我最近初做RTPCR，想请教一下高手是不是用于RTPCR的每对引物使用前都得进行模板为水的空白对照实验，以确定后期熔解曲线的峰是不是出现了特异性扩增，望高手解答，谢谢！！

空白对照是看污染情况，溶解曲线是看扩增的特异性（染料法）
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2楼2011-06-17 18:21:21
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yuyan225

金虫 (小有名气)
那如何确定在PCR的体系里就只有有引物二聚体，当cDNA里扩不出相应的片段是万一有了引物二聚体，而我的片段条带大小又与引物二聚体大小差不多，如果出现了引物二聚体熔解曲线也有峰，那么我做个水位模板的空白对照就可以看出引物二聚体的情况，我是这么想的，望高手继续指点~~
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3楼2011-06-18 17:04:58
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+7): 谢谢指教，收教了 2011-06-19 11:25:41
dhd997(金币+5): good 2011-06-25 13:34:58
看空白对照是一个办法，不过就算加利模板，在融解曲线里也是可以看出引物二聚体的峰的。就算大小差不多，引物二聚体的结合强度肯定不及PCR产物，Tm值要低些，跟产物相比，出现峰的位置肯定在温度更低的地方。而且一般峰也相对更低（荧光信号相对弱）。

如果有产物，那扩增曲线很早就会出现；如果是30个循环之后才出现扩增曲线，那可能就是引物二聚体了。

空白对照，应该每次PCR里面都加入，可以检查是否有污染及引物二聚体的情况。

楼主在3楼里担心的片段大小与引物二聚体差不多这种情况，应该很难出现吧。两条引物加起来也就50bp不到，而荧光定量PCR的产物一般在150bp到300bp。所以，也可以在PCR之后跑个琼脂糖凝胶电泳，一般能区分开PCR产物和引物二聚体。
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4楼2011-06-18 22:13:58
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yuyan225

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-18 22:13:58:
看空白对照是一个办法，不过就算加利模板，在融解曲线里也是可以看出引物二聚体的峰的。就算大小差不多，引物二聚体的结合强度肯定不及PCR产物，Tm值要低些，跟产物相比，出现峰的位置肯定在温度更低的地方。而且 ...

还有一个问题在想您请教，空白对照要不要每对引物都加，或者每个板设一个空白对照就够了？
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5楼2011-06-19 11:27:39
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-06-19 11:27:39:
还有一个问题在想您请教，空白对照要不要每对引物都加，或者每个板设一个空白对照就够了？

每对引物都要设空白对照。配mix时往往多配一管的量，可以防止分装时不够用（经常发生的情况），要求不严格时，剩下的mix加上水就可以作为空白对照了。
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6楼2011-06-19 12:06:44
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yuyan225

金虫 (小有名气)
谢谢，受教了
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7楼2011-06-20 08:43:15
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 学习了！ 2011-06-24 16:20:02
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-06-17 18:21:21:
空白对照是看污染情况，溶解曲线是看扩增的特异性（染料法）

是引物二聚体还是目的条带可以通过电泳来判断，电泳时间足够长时，引物二聚体会变模糊而目的条带不会。
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静心做事。
8楼2011-06-24 15:11:43
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 费心了！不过有没有办法区分引物二聚体和错配扩增的峰呢？请教下。 2011-06-24 20:40:38
引用回帖:
Originally posted by jiangyhai at 2011-06-24 15:11:43:
是引物二聚体还是目的条带可以通过电泳来判断，电泳时间足够长时，引物二聚体会变模糊而目的条带不会。

引物二聚体可以直接根据溶解曲线峰所对应的温度做出判断。
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9楼2011-06-24 17:57:58
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-25 13:35:22
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-06-24 17:57:58:
引物二聚体可以直接根据溶解曲线峰所对应的温度做出判断。

染料法的RT-PCR，要把扩增曲线和溶解曲线结合起来来检验扩增的结果，主要是检查扩增的特异性，如果出现由于错配而产生的非特异性产物，最好是另外做下电泳检测更为保险，实际上是一条扩增曲线对应一个PCR产物，而且应该做几个重复样品，这时应该多根据扩增曲线去做判断。没有经验的话就做个电泳。
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10楼2011-06-25 00:48:08
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