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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
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yuyan225

金虫 (小有名气)

[求助] 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题

各位虫友大家好，我最近初做RTPCR，想请教一下高手是不是用于RTPCR的每对引物使用前都得进行模板为水的空白对照实验，以确定后期熔解曲线的峰是不是出现了特异性扩增，望高手解答，谢谢！！
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1楼2011-06-17 17:10:30
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yuyan225(金币+3): 2011-06-18 16:59:44
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-18 21:53:39
引用回帖:
Originally posted by yuyan225 at 2011-06-17 17:10:30:
各位虫友大家好，我最近初做RTPCR，想请教一下高手是不是用于RTPCR的每对引物使用前都得进行模板为水的空白对照实验，以确定后期熔解曲线的峰是不是出现了特异性扩增，望高手解答，谢谢！！

空白对照是看污染情况，溶解曲线是看扩增的特异性（染料法）
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2楼2011-06-17 18:21:21
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 费心了！不过有没有办法区分引物二聚体和错配扩增的峰呢？请教下。 2011-06-24 20:40:38
引用回帖:
Originally posted by jiangyhai at 2011-06-24 15:11:43:
是引物二聚体还是目的条带可以通过电泳来判断，电泳时间足够长时，引物二聚体会变模糊而目的条带不会。

引物二聚体可以直接根据溶解曲线峰所对应的温度做出判断。
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9楼2011-06-24 17:57:58
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-25 13:35:22
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-06-24 17:57:58:
引物二聚体可以直接根据溶解曲线峰所对应的温度做出判断。

染料法的RT-PCR，要把扩增曲线和溶解曲线结合起来来检验扩增的结果，主要是检查扩增的特异性，如果出现由于错配而产生的非特异性产物，最好是另外做下电泳检测更为保险，实际上是一条扩增曲线对应一个PCR产物，而且应该做几个重复样品，这时应该多根据扩增曲线去做判断。没有经验的话就做个电泳。
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10楼2011-06-25 00:48:08
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