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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于细菌RT-PCR的一些问题，希望同行探讨一下
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chengcheng8901

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于细菌RT-PCR的一些问题，希望同行探讨一下 已有1人参与

最近在做白叶枯病原菌目的基因的RT-PCR，有些难题希望和各位探讨！  我用的是天根的试剂盒提取的菌液的总RNA，效果还好，点两微升胶图很清晰，有明亮的三条带，虽然最小的那一条有些模糊。
   但是提取的总RNA可能会有DNA污染，因此并需检测和纯化。以后面临了很多问题。
    1、我采用什么方法去检测有没有DNA污染？（因为当时考虑的原核生物里没有内含子，因为我想采取用目的基因的引物去扩我              提取的总RNA，我认为的是如何能扩出来目的片段则有DNA污染，因为我用的酶是普通的taq酶。不知道这种方法是否合适？）
    2、有没有纯化效率高的方法？（我采用的是DNase I 消化，然后再抽提的方法，这里我有个问题是我能不能省去抽提的步骤，直接消化完后进行检测，再反转录）
    3、由于在选择actin的时候考虑的真核和原核生物的看家基因不同，所以只能选择16srRNA作为control。
   4、选择引物的时候？（一般真核生物都是选择oligdT，但是原核生物怎么办？用随机引物吗？）
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1楼 2011-05-04 13:59:49
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475502411

铜虫 (著名写手)
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西瓜(金币+5, EPI+1): Good！不过原核生物的mRNA一般没有或只有短的3‘端Poly A，用oligo dT不好吧。 2011-05-04 22:12:48
1.抽好RNA后电泳，因为基因组很大，一般在加样孔的起始处，如果有亮带，就说明有基因组，需要消化去除
2.用去基因组的试剂盒，2min搞定
3.可以有不同的管家基因，但是16s比较常用
4.可以用oligodT，随机引物或者特异性引物都可以
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
2楼2011-05-04 20:56:08
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chengcheng8901

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-05-04 20:56:08:
1.抽好RNA后电泳，因为基因组很大，一般在加样孔的起始处，如果有亮带，就说明有基因组，需要消化去除
2.用去基因组的试剂盒，2min搞定
3.可以有不同的管家基因，但是16s比较常用
4.可以用oligodT，随机引物或 ...

你好！
1、我跑出的条带除了三条条带以外，在加样孔的起始处并没有发现明显的亮带，但是我在用普通taq酶扩增我提取的RNA时，确扩出了目的片段了，这样能不能说明有DNA污染啊？
2、原核生物里不是没有polyA结构吗？或者很短？用OligodT 去反转录的时候能反转出来吗？
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3楼2011-05-06 15:40:18
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chengcheng8901

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-05-04 20:56:08:
1.抽好RNA后电泳，因为基因组很大，一般在加样孔的起始处，如果有亮带，就说明有基因组，需要消化去除
2.用去基因组的试剂盒，2min搞定
3.可以有不同的管家基因，但是16s比较常用
4.可以用oligodT，随机引物或 ...

还有一个小问题就是一般原核生物里，mRNA存在的时间很短，有的几秒钟，有的也就几分钟，因此我想要获知我所需目的基因的表达情况。我在提取RNA时，我能不能在获得新鲜菌液后用液氮速冻，这样mRNA就不会很快的被分解！然后再溶解后提取RNA.不知道这样行不行？
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4楼2011-05-06 16:07:19
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475502411

铜虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by chengcheng8901 at 2011-05-06 16:07:19:
还有一个小问题就是一般原核生物里，mRNA存在的时间很短，有的几秒钟，有的也就几分钟，因此我想要获知我所需目的基因的表达情况。我在提取RNA时，我能不能在获得新鲜菌液后用液氮速冻，这样mRNA就不会很快的被 ...

这个就不清楚了，我提的是总的RNA，不过我想降解的没有那么快，按RNA提取试剂盒的操作说明惊醒就没有什么问题，祝你好运
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2011-05-07 12:57:08
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