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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助！关于RT-PCR的问题！

最近在做关于反转录PCR，想请教几个问题：
1.如何确定RNA反转录是否成功？（是否可以跑下琼脂糖电泳）
2.我反转录之后的PCR中，电泳结果什么也没有，就连内参引物也没有扩出来，不知是什么原因？
我反转录用的是takara的PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，之后的PCR用的是Pyrobest® DNA Polymerase！
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1楼2011-11-07 17:01:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5): 鼓励积极应助！ 2011-11-07 20:07:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by guifang at 2011-11-07 17:38:43:
反转录完了之后，你可以跑个电泳，点上Marker，然后电泳，对照Marker上的，用凝胶分析系统分析就知道反转录的DNA是多大的了，如果跟你的目的基因基本一致，就证明反转录成功。
电泳结果没有，内参也没出来，你可 ...

个人表示不同意。
反转录酶很贵，cDNA跑胶跑胶很浪费啊。而且反转录产物量很少，直接跑胶看不到东西的。如果楼主不是用的基因特异性引物，而是用的Oligo dT或者随机引物，得到的是总的cDNA，跑胶根本一点意义都没有。

PCR没有结果，改变电泳时间跟电压是没用的。有产物的话，总会看到条带的。
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3楼2011-11-07 18:43:17
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普通回帖

guifang

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-11-07 20:07:25
反转录完了之后，你可以跑个电泳，点上Marker，然后电泳，对照Marker上的，用凝胶分析系统分析就知道反转录的DNA是多大的了，如果跟你的目的基因基本一致，就证明反转录成功。
电泳结果没有，内参也没出来，你可以尝试电泳时间加长，或者加大电泳电压，再出不来的话，估计引物问题了。
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2楼2011-11-07 17:38:43
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
确定反转录是否成功，一般就是扩增内参基因了，内参扩增不出来就是有问题的。当然，如果怀疑PCR，也可以换一对引物来扩增内参，不过内参扩不出来，个人认为反转录就是失败了。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-11-7 at 20:33 ]
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4楼2011-11-07 18:44:53
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-07 18:44:53:
确定反转录是否成功，一般就是扩增内参基因了，内参扩增出来就是有问题的。当然，如果怀疑PCR，也可以换一对引物来扩增内参，不过内参扩不出来，个人认为反转录就是失败了。

“内参扩增出来就是有问题的”？？？这是什么意思啊，应该是内参扩增出来就证明反转录成功了吧！
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5楼2011-11-07 18:54:10
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-11-07 18:54:10:
“内参扩增出来就是有问题的”？？？这是什么意思啊，应该是内参扩增出来就证明反转录成功了吧！

打漏了个“不”字
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6楼2011-11-07 18:59:06
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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xuzhu598(金币+2): 2011-11-13 21:11:07
我们一般内参都没跑出来的，，会自动放弃该反转录产物的。 貌似反转录产物最基本的就是要跑出内参吧， 你RNA提得怎样？ 如果RNA还可以，建议再RT一次吧。
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7楼2011-11-08 09:59:16
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我和我自己

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xuzhu598(金币+1): 2011-11-13 21:11:21
内参如果跑不出来一般就是说反转录不成功，用一下别人正在用内参呗，这样比较说明问题
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8楼2011-11-08 13:29:56
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star445927

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

xuzhu598(金币+4): 2011-11-13 21:11:53
引用回帖:
1楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-11-07 17:01:04:
最近在做关于反转录PCR，想请教几个问题：
1.如何确定RNA反转录是否成功？（是否可以跑下琼脂糖电泳）
2.我反转录之后的PCR中，电泳结果什么也没有，就连内参引物也没有扩出来，不知是什么原因？
我反转录用的 ...

我以前实验中也有类似的问题，RNA提取跑电泳条带清晰没有问题，反转录之后上荧光定量PCR没有产物，荧光信号不收集。最后我做了一组实验，DNA+内参和cDNA+内参进行PCR扩增，结果发现第一组出线条带，2组没有出现条带，最后我换一个反转录试剂盒，就出结果了，所以可能是试剂盒时间太长或酶降解了。
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9楼2011-11-08 17:04:21
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liweiwei0812

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
xuzhu598(金币+1): 2011-11-13 21:12:03
xuzhu598: 金币+2 2012-04-06 00:17:26
没有扩出内参，可以再调整一下PCR条件，用别人做过的cDNA做阳性对照，用RNA和水做阴性对照，如果你的还是没有扩增产物，就重新做吧。
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10楼2011-11-08 17:11:53
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