应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！关于RT-PCR的问题！
211/3返回列表123下一页
查看: 3591  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xuzhu598

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助！关于RT-PCR的问题！

最近在做关于反转录PCR，想请教几个问题：
1.如何确定RNA反转录是否成功？（是否可以跑下琼脂糖电泳）
2.我反转录之后的PCR中，电泳结果什么也没有，就连内参引物也没有扩出来，不知是什么原因？
我反转录用的是takara的PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，之后的PCR用的是Pyrobest® DNA Polymerase！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-11-07 17:01:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5): 鼓励积极应助！ 2011-11-07 20:07:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by guifang at 2011-11-07 17:38:43:
反转录完了之后，你可以跑个电泳，点上Marker，然后电泳，对照Marker上的，用凝胶分析系统分析就知道反转录的DNA是多大的了，如果跟你的目的基因基本一致，就证明反转录成功。
电泳结果没有，内参也没出来，你可 ...

个人表示不同意。
反转录酶很贵，cDNA跑胶跑胶很浪费啊。而且反转录产物量很少，直接跑胶看不到东西的。如果楼主不是用的基因特异性引物，而是用的Oligo dT或者随机引物，得到的是总的cDNA，跑胶根本一点意义都没有。

PCR没有结果，改变电泳时间跟电压是没用的。有产物的话，总会看到条带的。
赞一下(3人) 回复此楼
3楼2011-11-07 18:43:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

guifang

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-11-07 20:07:25
反转录完了之后，你可以跑个电泳，点上Marker，然后电泳，对照Marker上的，用凝胶分析系统分析就知道反转录的DNA是多大的了，如果跟你的目的基因基本一致，就证明反转录成功。
电泳结果没有，内参也没出来，你可以尝试电泳时间加长，或者加大电泳电压，再出不来的话，估计引物问题了。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-11-07 17:38:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
确定反转录是否成功，一般就是扩增内参基因了，内参扩增不出来就是有问题的。当然，如果怀疑PCR，也可以换一对引物来扩增内参，不过内参扩不出来，个人认为反转录就是失败了。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-11-7 at 20:33 ]
赞一下 回复此楼
4楼2011-11-07 18:44:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-07 18:44:53:
确定反转录是否成功，一般就是扩增内参基因了，内参扩增出来就是有问题的。当然，如果怀疑PCR，也可以换一对引物来扩增内参，不过内参扩不出来，个人认为反转录就是失败了。

“内参扩增出来就是有问题的”？？？这是什么意思啊，应该是内参扩增出来就证明反转录成功了吧！
赞一下 回复此楼
5楼2011-11-07 18:54:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-11-07 18:54:10:
“内参扩增出来就是有问题的”？？？这是什么意思啊，应该是内参扩增出来就证明反转录成功了吧！

打漏了个“不”字
赞一下 回复此楼
6楼2011-11-07 18:59:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xuzhu598(金币+2): 2011-11-13 21:11:07
我们一般内参都没跑出来的，，会自动放弃该反转录产物的。 貌似反转录产物最基本的就是要跑出内参吧， 你RNA提得怎样？ 如果RNA还可以，建议再RT一次吧。
赞一下 回复此楼
7楼2011-11-08 09:59:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我和我自己

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xuzhu598(金币+1): 2011-11-13 21:11:21
内参如果跑不出来一般就是说反转录不成功，用一下别人正在用内参呗，这样比较说明问题
赞一下 回复此楼
8楼2011-11-08 13:29:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

star445927

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

xuzhu598(金币+4): 2011-11-13 21:11:53
引用回帖:
1楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-11-07 17:01:04:
最近在做关于反转录PCR，想请教几个问题：
1.如何确定RNA反转录是否成功？（是否可以跑下琼脂糖电泳）
2.我反转录之后的PCR中，电泳结果什么也没有，就连内参引物也没有扩出来，不知是什么原因？
我反转录用的 ...

我以前实验中也有类似的问题，RNA提取跑电泳条带清晰没有问题，反转录之后上荧光定量PCR没有产物，荧光信号不收集。最后我做了一组实验，DNA+内参和cDNA+内参进行PCR扩增，结果发现第一组出线条带，2组没有出现条带，最后我换一个反转录试剂盒，就出结果了，所以可能是试剂盒时间太长或酶降解了。
赞一下 回复此楼
9楼2011-11-08 17:04:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liweiwei0812

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
xuzhu598(金币+1): 2011-11-13 21:12:03
xuzhu598: 金币+2 2012-04-06 00:17:26
没有扩出内参，可以再调整一下PCR条件，用别人做过的cDNA做阳性对照，用RNA和水做阴性对照，如果你的还是没有扩增产物，就重新做吧。
赞一下 回复此楼
10楼2011-11-08 17:11:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xuzhu598 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 基金不中，共勉 +5 eulota 2026-08-26 5/250 2026-08-26 23:33 by young90
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +3 a089 2026-08-26 3/150 2026-08-26 23:21 by young90
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 +4 晴天加油 2026-08-26 5/250 2026-08-26 21:27 by 木风9012
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +3 苏东坡二世 2026-08-23 3/150 2026-08-25 10:35 by shisan1313
[基金申请] 我面上完蛋了 +13 且听虎啸 2026-08-20 14/700 2026-08-25 09:10 by mrkang
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭