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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！关于RT-PCR的问题！
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如来的观音

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-11-07 17:01:04:
最近在做关于反转录PCR，想请教几个问题：
1.如何确定RNA反转录是否成功？（是否可以跑下琼脂糖电泳）
2.我反转录之后的PCR中，电泳结果什么也没有，就连内参引物也没有扩出来，不知是什么原因？
我反转录用的 ...

非常同意“西瓜”的观点，只是我们在逆转录之前都会测一下PRNA的浓度，然后再反转录，只要严格按照KIT的步骤来做一般不会有问题的。还是考虑逆转录失败。
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11楼2011-11-09 10:33:44
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by star445927 at 2011-11-08 17:04:21:
我以前实验中也有类似的问题，RNA提取跑电泳条带清晰没有问题，反转录之后上荧光定量PCR没有产物，荧光信号不收集。最后我做了一组实验，DNA+内参和cDNA+内参进行PCR扩增，结果发现第一组出线条带，2组没有出现条 ...

真有可能是我的反转录酶失活了，你用的是哪家公司的？
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12楼2011-11-12 23:04:43
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-07 18:59:06:
打漏了个“不”字

请问版主，反转录酶放在四度下会失活吗？我那天放了一天一夜，不知道是不是反转录酶失活的缘故！
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13楼2011-11-12 23:06:55
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 丙氨酸密码子 at 2011-11-08 09:59:16:
我们一般内参都没跑出来的，，会自动放弃该反转录产物的。 貌似反转录产物最基本的就是要跑出内参吧， 你RNA提得怎样？ 如果RNA还可以，建议再RT一次吧。

提取的还可以吧，现在我感觉可能是我的反转录酶失活了，我放在了4度下！http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3635081这是我提取的RNA电泳结果
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14楼2011-11-12 23:12:20
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
wanhscn(金币+1): 鼓励版主应助！ 2011-11-14 16:39:44
引用回帖:
13楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-11-12 23:06:55:
请问版主，反转录酶放在四度下会失活吗？我那天放了一天一夜，不知道是不是反转录酶失活的缘故！

……这玩意应该是要存在-20℃的吧……反转录酶很贵的说，怎么不小心点啊！
以前有一次，我们的一管反转录酶用完了被人扔了。后面我急用就从垃圾桶里捡了回来，离心下来一点拿去用了，也反转录出来了。当时在室温过了一夜。你的情况我不知道，但是个人认为活力肯定降低了。
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15楼2011-11-13 09:57:10
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-13 09:57:10:
……这玩意应该是要存在-20℃的吧……反转录酶很贵的说，怎么不小心点啊！
以前有一次，我们的一管反转录酶用完了被人扔了。后面我急用就从垃圾桶里捡了回来，离心下来一点拿去用了，也反转录出来了。当时在室温 ...

啊？版主的比我更神奇呀，哈哈，我现在也搞不清楚到底是什么原因！就算是活力降低了，内参应该能扩出来呀，但实际上一点条带也没有，很是郁闷呀！今天再试一次，不行的话只能重新买反转录酶了，下次一定谨记版主的话！
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16楼2011-11-13 11:52:32
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-11-07 17:01:04:
最近在做关于反转录PCR，想请教几个问题：
1.如何确定RNA反转录是否成功？（是否可以跑下琼脂糖电泳）
2.我反转录之后的PCR中，电泳结果什么也没有，就连内参引物也没有扩出来，不知是什么原因？
我反转录用的 ...

只有两种可能：1.反转录失败 2. 内参引物有问题。多数情况下是反转录失败。
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17楼2011-11-13 14:56:09
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小小懒猫儿

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

跑电泳没有条带，很大原因是你在提取RNA的时候，RNA降解了。操作过程中一定要避免污染，严格按照操作步骤来进行
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小小懒猫
18楼2011-11-14 09:34:12
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RNA反转录是否成功是不可以用胶检测的, 如目的基因不需要克隆不必用Pyrobest® DNA Polymerase ,高保真酶很娇贵,用ExTaq就足够了,片断短的克隆也没问题,内参和你的基因没有必然的联系,如克隆基因反转录产物加5ul，定量稀释10倍取1-2ul即可，没有结果尽早重新提取RNA重新玩
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19楼2012-03-21 09:24:31
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guixiaohua

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
20楼2012-09-04 16:54:20
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