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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 可变剪切体RT-PCR检测的技术问题
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章信来

木虫 (正式写手)

[求助] 可变剪切体RT-PCR检测的技术问题

各位虫友：
我有个基因存在不止一种类型可变剪切情况，当共同点是基因中间片段缺失，我想设计两端保守位的引物，采用RT-PCR的方法检测不同组织间的分布规律，如果都存在的话会同时扩增出几条大小不等的目的条带，RT-PCR结果则完全不是那么回事，所有组织只能扩增出一条最小的可变剪切体，其他的，尤其是未发生可变剪切的原始基因都扩增不出来，请各位虫友帮忙分析下原因和解决办法（PCR条件优化很多次了，不见任何改观），谢谢各位！
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1楼2012-11-23 08:09:49
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cnb1987

银虫 (小有名气)
你好，我想问问，对于基因的不同剪切体如何鉴定？
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2楼2013-04-02 16:19:22
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

How do you optimize your PCR condition? I have met the same thing. I use KOD to amplify my target gene. I only got the small fragment. Later I increased the denature and primer annealing time (from 20s to 25s). Interestingly, the bigger band appeared.
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immunologyparasite
3楼2013-04-02 21:11:06
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章信来

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by robustli at 2013-04-02 21:11:06
How do you optimize your PCR condition? I have met the same thing. I use KOD to amplify my target gene. I only got the small fragment. Later I increased the denature and primer annealing time (from 2 ...

in fact, i haven't  solve this question yet, i want to do northern-blot, your suggestion maybe work, i will try it, thanks!
the big problem of AS is how to study the function, especially the different function to wild type gene, do you have any good idea?
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4楼2013-04-03 19:19:38
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章信来

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cnb1987 at 2013-04-02 16:19:22
你好，我想问问，对于基因的不同剪切体如何鉴定？

你是说如何确定一个基因是否存在可变剪切体对吧？
我的情况是用基因两端特异性引物做RT-PCR，电泳结果发现几条较为特异的目的片段，就克隆测序回来发现是基因mRNA中间出现缺失造成的，缺失的两端序列符合可变剪切的AT-AG原则（好像是AT-AG），所以基本上判断为AS，查阅相关文献发现哺乳动物基因可变剪切事件稀松平常，貌似超过75%以上的基因能进行AS。
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5楼2013-04-03 19:27:12
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cnb1987

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 章信来 at 2013-04-03 19:27:12
你是说如何确定一个基因是否存在可变剪切体对吧？
我的情况是用基因两端特异性引物做RT-PCR，电泳结果发现几条较为特异的目的片段，就克隆测序回来发现是基因mRNA中间出现缺失造成的，缺失的两端序列符合可变剪切 ...

嗯，那你现在是怎么分析这些剪切体的呢？对于如何分析这些剪切体编码什么样的蛋白。还有如果要做这些剪切体的表达，改如何做呢？
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6楼2013-07-05 09:45:59
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章信来

木虫 (正式写手)
我一直没有什么高明的方法，首先作NB和WB，希望在组织中找到天然蛋白（我的并没发生移码，所以蛋白还是和WT的相同，只是长度差异），之后在细胞水平看看信号通路是否有变化。由于没有特异性抗体，我在开始就出了问题，你的情况如何？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2013-07-06 22:15:59
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

第一、你怎么知道是不止一种可变剪切体
第二、即使存在不止一种的可变剪切体，它们在不同组织的表达量高低如何，如果其他的表达量远远低于你那个所谓的最短的“可变剪切形式”（准确地说应该叫做：剪切形式），那么其他剪切形式是不会在你RT-PCR的过程中出现，至少几率很小。
第三、即使出现，也会由于产量太小而不会观察到。
第四、要确定是何种剪切方式，可与基因组DNA比较。是内含子保留，还是5’剪切，3‘剪切等等’
第五、在获得可变剪切体后，可以构建表达载体，诱导蛋白表达。
第六、构建真核表达载体、转染细胞，是该基因过表达，检测该基因所在信号通路上下游基因表达量差异，确定那种剪切体是其主要作用的。
实验顺利~~~
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总有一天我要修改用户名。
8楼2013-07-07 08:34:52
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aiguoss0902

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 章信来 at 2013-04-03 19:19:38
in fact, i haven't  solve this question yet, i want to do northern-blot, your suggestion maybe work, i will try it, thanks!
the big problem of AS is how to study the function, especially the differ ...

could you have solve the problem with northern-blot?
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9楼2015-01-27 09:29:52
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