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可变剪切体RT-PCR检测的技术问题
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各位虫友： 我有个基因存在不止一种类型可变剪切情况，当共同点是基因中间片段缺失，我想设计两端保守位的引物，采用RT-PCR的方法检测不同组织间的分布规律，如果都存在的话会同时扩增出几条大小不等的目的条带，RT-PCR结果则完全不是那么回事，所有组织只能扩增出一条最小的可变剪切体，其他的，尤其是未发生可变剪切的原始基因都扩增不出来，请各位虫友帮忙分析下原因和解决办法（PCR条件优化很多次了，不见任何改观），谢谢各位！ |
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2楼2013-04-02 16:19:22
3楼2013-04-02 21:11:06
4楼2013-04-03 19:19:38
5楼2013-04-03 19:27:12
6楼2013-07-05 09:45:59
7楼2013-07-06 22:15:59
【答案】应助回帖
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第一、你怎么知道是不止一种可变剪切体 第二、即使存在不止一种的可变剪切体，它们在不同组织的表达量高低如何，如果其他的表达量远远低于你那个所谓的最短的“可变剪切形式”（准确地说应该叫做：剪切形式），那么其他剪切形式是不会在你RT-PCR的过程中出现，至少几率很小。 第三、即使出现，也会由于产量太小而不会观察到。 第四、要确定是何种剪切方式，可与基因组DNA比较。是内含子保留，还是5’剪切，3‘剪切等等’ 第五、在获得可变剪切体后，可以构建表达载体，诱导蛋白表达。 第六、构建真核表达载体、转染细胞，是该基因过表达，检测该基因所在信号通路上下游基因表达量差异，确定那种剪切体是其主要作用的。 实验顺利~~~ |
8楼2013-07-07 08:34:52
9楼2015-01-27 09:29:52
