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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教RT-PCR 扩增问题
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luckking

金虫 (正式写手)

[求助] 请教RT-PCR 扩增问题

用的Takara  DR050s PCR扩怎程序大致为：
98℃——5min
·························
98℃——10
55℃——15s                 ×30循环
68℃——3min
·························
· 68℃——5min   
引物TM 为 66.1 和64.8  扩不出来条带怎么优化
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1楼 2012-05-13 10:12:12
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回帖置顶 ( 共有2个 )

gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
luckking: 金币+2 2012-05-13 14:34:07
amisking: 回帖置顶 2012-05-13 17:34:40
做RT-PCR哪有用这么长的片段，扩增效率会很低。一般也就100-200bp。这么长的片断，P出来也不能说明问题。还有，循环数是要摸索的，太多的话就到了PCR的平台期，根本就看不出差别了，我们做细菌时循环数都在20个循环左右。
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4楼2012-05-13 12:19:30
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
amisking: 回帖置顶 2012-05-13 17:34:46
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-13 17:34:53
引用回帖:
6楼: Originally posted by luckking at 2012-05-13 14:47:59:
能不能给个好方法 ？

你那个酶我没用过，看了说明书，貌似是很神奇的东西。
现在问题是P不出来，可以采取延长退火时间，降低退火温度，增加延伸时间，增加循环数这些通用的方法。
不过你既然是反转录PCR，那也有可能是cDNA模板质量不好。优化PCR之前，最好确认下模板质量，可以用actin等内参基因来做PCR（可以用Taq等便宜的酶），假如内参都扩增不出来，那很显然cDNA不能用。

另外，你的片段不到3kb，为毛要用这个酶啊。我看它的特长是扩增长片段，能到30kb，这是挺了不起的。相应的，价格应该很贵吧？这个很浪费啊，估计老板还不知道你这么干吧？呵呵~我建议你还是用Takara的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase，程序用普通的就行了。
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8楼2012-05-13 16:14:33
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普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
你片段多长？
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2楼2012-05-13 10:42:26
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luckking

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-13 10:42:26:
你片段多长？

2809
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3楼2012-05-13 11:18:51
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-05-13 12:19:30:
做RT-PCR哪有用这么长的片段，扩增效率会很低。一般也就100-200bp。这么长的片断，P出来也不能说明问题。还有，循环数是要摸索的，太多的话就到了PCR的平台期，根本就看不出差别了，我们做细菌时循环数都在20个循 ...

楼主估计是要扩增基因，不是做定量。RT-PCR是反转录PCR的简称，即反转录PCR，只要是用cDNA做模板的PCR都可以称为RT-PCR,不是专门指定量的哦。
定量PCR的简称是qPCR。另外，荧光定量PCR即real-time PCR是不简写为RT-PCR的（为了与反转录PCR区分）。如果是用cDNA为模板做real-time，得称为qRT-PCR。
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luckking
5楼2012-05-13 14:40:52
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luckking

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-13 14:40:52:
楼主估计是要扩增基因，不是做定量。RT-PCR是反转录PCR的简称，即反转录PCR，只要是用cDNA做模板的PCR都可以称为RT-PCR,不是专门指定量的哦。
定量PCR的简称是qPCR。另外，荧光定量PCR即real-time PCR是不简写为 ...

能不能给个好方法 ？
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6楼2012-05-13 14:47:59
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luckking

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-13 14:40:52:
楼主估计是要扩增基因，不是做定量。RT-PCR是反转录PCR的简称，即反转录PCR，只要是用cDNA做模板的PCR都可以称为RT-PCR,不是专门指定量的哦。
定量PCR的简称是qPCR。另外，荧光定量PCR即real-time PCR是不简写为 ...

7楼2012-05-13 14:49:06
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
我的观点与楼上兄弟有点儿不一样。。你引物TM 为 66.1 和64.8， 大概尝试用个58-60°的退火温度试试看呢。另外，能否把延伸温度提高至72°。
当然如果你用的是TAKARA的专用反转录试剂盒 情况就另当别论。。
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
9楼2012-05-14 22:41:56
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