应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教RT-PCR 扩增问题
91/1返回列表
查看: 1668  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

luckking

金虫 (正式写手)

[求助] 请教RT-PCR 扩增问题

用的Takara  DR050s PCR扩怎程序大致为：
98℃——5min
·························
98℃——10
55℃——15s                 ×30循环
68℃——3min
·························
· 68℃——5min   
引物TM 为 66.1 和64.8  扩不出来条带怎么优化
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-05-13 10:12:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
luckking: 金币+2 2012-05-13 14:34:07
amisking: 回帖置顶 2012-05-13 17:34:40
做RT-PCR哪有用这么长的片段，扩增效率会很低。一般也就100-200bp。这么长的片断，P出来也不能说明问题。还有，循环数是要摸索的，太多的话就到了PCR的平台期，根本就看不出差别了，我们做细菌时循环数都在20个循环左右。
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-13 12:19:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
amisking: 回帖置顶 2012-05-13 17:34:46
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-13 17:34:53
引用回帖:
6楼: Originally posted by luckking at 2012-05-13 14:47:59:
能不能给个好方法 ？

你那个酶我没用过，看了说明书，貌似是很神奇的东西。
现在问题是P不出来，可以采取延长退火时间，降低退火温度，增加延伸时间，增加循环数这些通用的方法。
不过你既然是反转录PCR，那也有可能是cDNA模板质量不好。优化PCR之前，最好确认下模板质量，可以用actin等内参基因来做PCR（可以用Taq等便宜的酶），假如内参都扩增不出来，那很显然cDNA不能用。

另外，你的片段不到3kb，为毛要用这个酶啊。我看它的特长是扩增长片段，能到30kb，这是挺了不起的。相应的，价格应该很贵吧？这个很浪费啊，估计老板还不知道你这么干吧？呵呵~我建议你还是用Takara的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase，程序用普通的就行了。
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-13 16:14:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
你片段多长？
回复此楼
2楼2012-05-13 10:42:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luckking

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-13 10:42:26:
你片段多长？

2809
回复此楼
3楼2012-05-13 11:18:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-05-13 12:19:30:
做RT-PCR哪有用这么长的片段，扩增效率会很低。一般也就100-200bp。这么长的片断，P出来也不能说明问题。还有，循环数是要摸索的，太多的话就到了PCR的平台期，根本就看不出差别了，我们做细菌时循环数都在20个循 ...

楼主估计是要扩增基因，不是做定量。RT-PCR是反转录PCR的简称，即反转录PCR，只要是用cDNA做模板的PCR都可以称为RT-PCR,不是专门指定量的哦。
定量PCR的简称是qPCR。另外，荧光定量PCR即real-time PCR是不简写为RT-PCR的（为了与反转录PCR区分）。如果是用cDNA为模板做real-time，得称为qRT-PCR。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

luckking
5楼2012-05-13 14:40:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luckking

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-13 14:40:52:
楼主估计是要扩增基因，不是做定量。RT-PCR是反转录PCR的简称，即反转录PCR，只要是用cDNA做模板的PCR都可以称为RT-PCR,不是专门指定量的哦。
定量PCR的简称是qPCR。另外，荧光定量PCR即real-time PCR是不简写为 ...

能不能给个好方法 ？
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-13 14:47:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luckking

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-13 14:40:52:
楼主估计是要扩增基因，不是做定量。RT-PCR是反转录PCR的简称，即反转录PCR，只要是用cDNA做模板的PCR都可以称为RT-PCR,不是专门指定量的哦。
定量PCR的简称是qPCR。另外，荧光定量PCR即real-time PCR是不简写为 ...

7楼2012-05-13 14:49:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
我的观点与楼上兄弟有点儿不一样。。你引物TM 为 66.1 和64.8， 大概尝试用个58-60°的退火温度试试看呢。另外，能否把延伸温度提高至72°。
当然如果你用的是TAKARA的专用反转录试剂盒 情况就另当别论。。
赞一下 回复此楼
勤奋、执着、专注，则无坚不破。
9楼2012-05-14 22:41:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 luckking 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +4 gjjjzhong 2026-08-18 5/250 2026-08-18 12:18 by ziyangfang
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +44 医学老男孩 2026-08-13 98/4900 2026-08-18 12:14 by wenky
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 8/400 2026-08-18 11:47 by gltch
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +4 Tide man 2026-08-14 5/250 2026-08-18 11:35 by Tide man
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 5/250 2026-08-18 11:25 by 無關想念
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +5 基诺咪客 2026-08-17 6/300 2026-08-18 11:06 by hunter无悔
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭