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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取RNA与做RT-PCR的问题
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johnny4890

新虫 (小有名气)

[求助] 提取RNA与做RT-PCR的问题

最近从霉菌中提取总rna，质量不好，反转录老是做不出来，而且pcr的时候经常把水那组p出条带来==。请大家给我点意见。先看看我的总rna电泳图。
（第一次）
（第二次）
所用的protocol是网上下载的山寨版本。如下：
RNA的提取
准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
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1楼2012-04-30 20:17:04
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 呵呵，欢迎交流 2012-05-02 13:38:59
johnny4890: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-02 21:38:16
嗯................
       我觉得，这样的RNA肯定是不能用的，电泳结果显示出你的RNA降解的比较严重，同样有Smear的话，基因组DNA还是有污染的，网上的这个Protocol我看基本的操作没有问题，主要是TRIzol试剂你是怎么配的呢，还是买的商业化TRIzol？同样具体应用到你菌的RNA提取上，不知道这个Protocol是否适用.............
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
2楼2012-04-30 20:38:11
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johnny4890

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-30 20:38:11:
嗯................
       我觉得，这样的RNA肯定是不能用的，电泳结果显示出你的RNA降解的比较严重，同样有Smear的话，基因组DNA还是有污染的，网上的这个Protocol我看基本的操作没有问题，主要是TRIzol试剂你 ...

TRIzol是买的商业化的。你们提rna的时候有专门的操作台吗？
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3楼2012-04-30 20:47:45
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★
mengfei8336: 金币+1, 谢谢分享 2012-05-02 13:52:23
引用回帖:
3楼: Originally posted by johnny4890 at 2012-04-30 20:47:45:
TRIzol是买的商业化的。你们提rna的时候有专门的操作台吗？

嗯
我们一般在超净台中操作 RNA的处理要小心 换手套 ep管 枪头均要DEPC处理过才比较放心
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Let God do with it as He wills
4楼2012-04-30 20:49:31
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johnny4890

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-30 20:49:31:
嗯
我们一般在超净台中操作 RNA的处理要小心 换手套 ep管 枪头均要DEPC处理过才比较放心

这些用具我都是买的rna操作专用的，就是那个超净台做什么操作的都有，没有专用的。。。
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5楼2012-04-30 21:23:02
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weng1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 恩，很认同啊 2012-05-02 13:39:17
毕业设计一直在做这个工作，只不过我提的是植物的。还是DEPC处理过比较放心，虽然比较麻烦。貌似RNA降解的比较厉害，试试用试剂盒提提，或许有帮助。
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寻找自己的未来。
6楼2012-05-01 14:44:26
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trizol11

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-03 17:50:14
你买的RNA专用的，最好也要在DEPC水里面泡一下，再灭后使用。细胞最好是用液氮研磨。第9步弃完上清，在把空管离一下。跑胶是将RNA稀释到40倍左右，你再试试。
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任重道远……
7楼2012-05-02 10:36:25
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-03 17:47:32
DEPC处理操作器具，离心管枪头等很重要，包括75%乙醇也用DEPC水配置和最好溶解RNA的无酶水。
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8楼2012-05-02 11:05:25
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Pushing2012

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 很有决心啊！ 2012-05-03 17:47:20
建议你把提的RNA  测下OD260/280  1.8-2.0 就可以放心做逆转录了，我之前做的植物的，足足做了十次才成功
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9楼2012-05-02 11:12:28
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johnny4890

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Pushing2012 at 2012-05-02 11:12:28:
建议你把提的RNA  测下OD260/280  1.8-2.0 就可以放心做逆转录了，我之前做的植物的，足足做了十次才成功

这么有毅力呀，佩服。
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10楼2012-05-02 13:49:56
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