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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助高手-棉花中RNA提取质量验证及反转后cDNA质量验证问题
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gn2003_0

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助高手-棉花中RNA提取质量验证及反转后cDNA质量验证问题 已有3人参与

我用试剂盒提取棉花RNA，由于新手有相关问题请教，首先是棉花RNA电泳后是不是应该有两条带，而我提取的RNA电泳图片如下（去离子甲酰胺变性，1.2%凝胶电泳）

定量后OD260/280=1.9-2.2之间，当时就做了反转。随后放置一周左右进行电泳验证，结果如下，泳道左侧八个为cDNA质量验证结果，有弥散的条带但是很弱，是不是CDNA质量不行，或者就是当初RNA提取的质量就不好不适合反转呢。
另外下面片子的右侧四个亮的泳道是我放置一周后的RNA质量，结果直接分不开带（我是没有变性直接跑的电泳）


[ Last edited by gn2003_0 on 2010-10-27 at 21:15 ]
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1楼 2010-10-27 21:13:19
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gn2003_0

金虫 (小有名气)
没人回复么 自己顶一下
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2楼2010-10-27 21:37:00
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-10-27 23:15:18
gn2003_0(金币+2):多谢 后四空调低亮度还可以分开条带，我得cDNA质量可以继续RT 么？ 2010-10-28 09:50:42
cDNA质量的好坏可以根据RT-PCR的结果判断，后四空的RNA浓度大，你在凝胶成像仪中照相的时候可以将亮度调暗一些，看看条带是不是可以分开。
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3楼2010-10-27 22:40:10
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won7

金虫 (小有名气)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-10-27 23:15:25
gn2003_0(金币+2):多谢指导 2010-10-28 09:49:30
正常情况下，RNA电泳有3条带。上图提取的RNA可能有DNA污染，盐离子浓度也比较高。但做普通RT-PCR还是没有问题的。下图RNA降解比较严重。
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4楼2010-10-27 22:45:48
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jackiechubut

木虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-28 08:38:04
RNA就算保存在-80度还是会有些降解的 而且聚丙烯酰胺和琼脂糖的分辨率还是不一样的，就算同样的样品看起来还是不一样的
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一笑寂寥空万古，三分明月照大江
5楼2010-10-28 00:47:08
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gn2003_0

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jackiechubut at 2010-10-28 00:47:08:
RNA就算保存在-80度还是会有些降解的 而且聚丙烯酰胺和琼脂糖的分辨率还是不一样的，就算同样的样品看起来还是不一样的

多谢 关键我是想知道下图的CDNA质量怎样。不知道从这凝胶图上能分析质量如何吗？
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6楼2010-10-28 09:52:49
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walker2898

银虫 (小有名气)
顶一下，我也遇到相似的问题，等待高手的出现。
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7楼2010-10-28 09:57:57
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪
★ ★ ★
silicare(金币+3):很详细 2010-10-28 11:55:06
gn2003_0(金币+6):你回答的很详细 多谢了 2010-10-30 10:18:46
一，RNA电泳时会出现3条带的，不用跑变性胶也行的，我们的RNA就跑正常琼脂糖胶也结果很好的。
二，你的OD值表明你的RNA质量还是可以的，应该不会出现RNA的问题。
三，反转后的电泳DNA弥散而且很不清楚，可能的原因有：从点样到开始跑胶的时间过长DNA弥散了；反转的时候出错了；第二种可能性大。
四，RNA就算在-80度都会降解的，所以如果是在-20度放置一周可能RNA会降解的。
五，个人觉得如果你的RNA是一直在-80度保存的话就再好好做一次反转。
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
8楼2010-10-28 10:37:33
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-10-27 22:40:10:
cDNA质量的好坏可以根据RT-PCR的结果判断，后四空的RNA浓度大，你在凝胶成像仪中照相的时候可以将亮度调暗一些，看看条带是不是可以分开。

P着试试吧
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9楼2010-10-28 12:11:04
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gn2003_0

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2010-10-28 10:37:33:
一，RNA电泳时会出现3条带的，不用跑变性胶也行的，我们的RNA就跑正常琼脂糖胶也结果很好的。
二，你的OD值表明你的RNA质量还是可以的，应该不会出现RNA的问题。
三，反转后的电泳DNA弥散而且很不清楚，可能的原 ...

你好 那么一般检测CDNA质量你用多大浓度的胶，跑多长时间电泳？多谢
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10楼2010-10-30 10:21:08
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